毛白杨4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL3）的酶学特征研究.pdfVIP

林 业科 学研 究 2013，26(5)：542～ 547 ForestResearch 文章编号：1001·1498(2013)05-0542-06 毛 白杨4香·豆酸 ：辅酶 A连接酶 (4CL3)的 酶学特征研究 饶国栋 ，张永卓 ，魏弘宜 ，蒋湘宁 ，陆 海 ，张建 国 (1．国家林 局林木埔育重点实验室，中国林业科学研究院林业研究所，北京 100091；2．北京林业大学，北京 100083) 摘要：为了进一步研究杨树4CL基因，以毛白杨为材料克隆到一个新的毛白杨4CL3基因。生物信息学分析结果显 示：该基因和其他4CL基因一样含有4CL基因家族2个保守框 BoxI和BoxII。将4CL3基因连接至原核表达载体 pQE30，表达纯化后测定其蛋白的比活力 ，结果显示：4CL3基因对不同底物表现出了不同的催化效率。对该基因的 最适温度和最适pH值测定后发现：4CL蛋白的最适温度为40℃，最适pH值为8．5，且在pH=9．0时有60％的活 力。采用HPLC—MS的方法，分析了4CL3蛋白对混合底物的催化情况 ，结果显示：在混合底物下，4CL3蛋白对4一香 豆酸、阿魏酸和肉桂酸都表现较高的活力，而对芥子酸和咖啡酸没有活力。 关键词：4一香豆酸：辅酶A连接酶；HPLC—MS；原核表达；毛白杨 中图分类号：s718．46 文献标识码 ：A EnzymaticCharacteristicsof4-coumarate：coenzymeA Ligase (4CL3)fromPopulustomentosa RAO Guo．dong ，ZHANG Yong。zhuo。 WEIHong—yi，JIANGXiang—ning ，LUHal，ZHANGJian—guo ， (1．KeyLaboratoryofTreeBreedingandCultivation，StateForestryAdministration，ResearchInstituteofForestry，ChineseAcademyofForestry Beijing 100091，China；2．BeijingForestryUniversity，Beijing 100083，China) Abstract：A new 4CLgenefrom Populustomentosa Can．wasclonedandnamedas4CL3．Bioinformaticsmethod wasusedtoanalysistheproteinsequenceofthis4CL3genealigningwithtwoother4CLproteins．Theauthorsf0und theconservedsequenceBoxIandBoxIIexistinthe4CLgenefamily．Prokaryoticexpressionwaywasusedtore— searchtheenzymefunctionofthis4CL3protein，theresultshowedthatthe4CL proteinhaddifferentenzymaticac— tivitytowardsthedifferentsubstrate．The4CL3proteinhadthebiggestenzymaticactivityatthetemperatureof40 oC，and ithadthebiggestenzymaticactivityatpH 8．5，thisenzymehastheabilityofresistingalkalineenviron— ment．The5substratesof4CLweremixedandthemethodofHPLC—MSwasusedtosurveytheconsumptionofthe substrateafterputting4CLenzymetostartthereaction．Itwasfoundthatbesidessinapictherewasnoconsumption ofcaffeiceither． Keywords：4CL；HPLC—MS