表没食子儿茶素没食子酸酯对肝癌Hep3B细胞自噬水平的影响及意义研究.pdfVIP

第八届全国肝脏疾病临床学术大会 ·271· 表没食子儿茶素没食子酸酯对肝癌Hep3B细胞 自噬水平的影响及意义研究 广西医科大学第一附属医院新药开发中心(530021)陈丽 广西壮族自治区人民医院消化内科姚。乏敏陈兴洲张国 广西医科大学药学院药理孝￡研室梁钢 【摘要】 目的 结果 h的相关系数r分别为0．873，0．96， 增殖抑制率与EGCG作用浓度(，=0．925，JP0．05)及作用时长均呈正相关(24、48和72 2．58)“g／m1。自噬相关基因beCAinl和At95 论EGCG具有明显下调肝癌Hep3B细胞自噬水平的作用；可能是其抑制肝癌细胞增殖的重要机制。 【关键诃l表没食子儿茶素没食子酸酯；肝癌；自噬；beclinl；At95 要机制。自噬在维持细胞存活、更新、物质再利用和内环境稳定中起着重要作用，与肿瘤发生、肿瘤治疗的关 系是近年来的研究热点【l】。没食子儿茶素没食子酸酯(EpigaUocatechin 茶素，具有多种生理和药理活性脚。研究显示，EGCG不仅能诱导肿瘤细胞发生凋亡、抑制细胞增殖，还可增 加肿瘤细胞对传统化疗药物的敏感眭及逆转肿瘤细胞的多药耐药陛口卅。但EGCG是否影响肿瘤细胞自噬迄今 未见报道。本研究如下通过观测EGCG治疗肝癌时的细胞自噬形态、自噬分子表达变化，初步探讨与药物作用 的关系，为EGCG的开拓应用提供新的实验依据。 材料和方法 Premix SYBR ExTaqTM Cell sijgnaUng和Novus公司，抗人多克隆GADPH一抗及其它二抗均购自美国Santa 培养基和胎牛血清来自于美国Thermo公司。 U／Ⅱ1L 血清的DMEM培养基(含2mM谷氨酰胺、1．0mmol／L丙酮酸钠、0．1mmol／L非必须氨基酸、100 111l／L 的青霉素、100U／IIll链霉素)中，于37℃、50CO，、饱和湿度的培养箱内传代培养。 3．透射电镜检测：40“g／mL 戊二醛1％锇酸固定液固定过夜，环氧树脂包埋，经醋酸铀及枸橼酸铅染色，在透射电子显微镜下观察细胞内 自噬泡的情况。 4．Real-time mm培养皿中，10、20、40“g／m1EGCG作 qPER检测：5×lOHep3B细胞种于35 用24 Green法 57一ACAGTGGACAGTTrGGCACA-37-CGGCAGCTC∽汀A研陌GT一3 7，下游引物为5 7；At95上游引 肝癌 7-CCAAAGCAGCAl]rGATGACCA-3 物为5 7，下游引物为5 7； 7一CATGAGAAGTATGACAACAGCCT一3 GADPH上游引物为5 7，下游引物为5 TACCAAA刚卜3 7。扩增条件为：95℃预变陛30S，1个循环；95℃变陛5S，60℃退火34S，共40个循环。 基因的mRNA相对表达量采用2‘△叫计算。 5．免疫印迹检测：Hep3B细胞经5、10、20、40“g／ml的EGCG处理24h后，将其裂解于含蛋白酶 mM