靶向NBS1基因的microRNA真核表达载体的构建及其活性鉴定.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（４）：７～１１ 靶向ＮＢＳ１基因的 ｍｉｃｒｏＲＮＡ真核表达载体的 构建及其活性鉴定 曹孙琼　任常山 （中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所　沈阳　１１０００１） 摘要　目的：构建靶向ＮＢＳ１基因的ｍｉｃｒｏＲＮＡ真核表达载体，鉴定其转染宫颈癌细胞株 Ｈｅｌａ后 的生物活性。方法：根据ＮＢＳ１ｍＲＮＡ序列设计合成４对ｐｒｅｍｉｃｒｏＲＮＡ片段，定向克隆到ｐｃＤＮＡ ６．２ＧＷ／ＥｍＧＦＰｍｉＲ真核表达载体上，并将其转染至Ｈｅｌａ细胞株中。采用菌落ＰＣＲ和测序分 析鉴定插入序列的完整性；采用实时荧光定量ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测鉴定重组体对ＮＢＳ１基因 表达的干扰效果以确定其生物活性。结果：构建的４组重组体插入片段的碱基序列完全正确。重 组体能干扰Ｈｅｌａ细胞ＮＢＳ１基因的表达，４组重组体ＮＢＳ１基因ｍＲＮＡ的表达水平和蛋白表达水 平均降低，其中ＮＢＳ１ｍｉ２组的表达水平最低。结论：构建的４组ＮＢＳ１ｍｉｃｒｏＲＮＡ重组体在Ｈｅｌａ 细胞株中都具有生物活性，且ＮＢＳ１ｍｉ２组的干扰作用最强。载体构建成功，为应用ｍｉｃｒｏＲＮＡ靶 向ＮＢＳ１的肿瘤基因治疗的研究奠定了基础。 关键词　ＮＢＳ１基因　ＲＮＡ干扰　ｍｉｃｒｏＲＮＡ 中图分类号　Ｑ７８２ 　　ｍｉｃｒｏＲＮＡ是近年来发现的一种内源性非蛋白质编 体的构建为应用ｍｉｃｒｏＲＮＡ靶向ＮＢＳ１的肿瘤基因治疗 码的约２２个核苷酸左右的单链小ＲＮＡ，其作用机制是 的研究奠定了基础。 通过与靶 ｍＲＮＡ的序列互补，与靶序列部分互补的 １　材料与方法 ｍｉｃｒｏＲＮＡ能抑制ｍＲＮＡ的翻译，与靶序列高度互补的 ｍｉｃｒｏＲＮＡ能引起靶 ｍＲＮＡ的剪切反应使 ｍＲＮＡ降解 １．１　材　料 即ＲＮＡ干扰作用，对细胞增殖、发育、分化、凋亡、病毒 　　线性化 ｐｃＤＮＡ６．２ＧＷ／ＥｍＧＦＰｍｉＲ真核表达载 ［１］ 体、大肠杆菌ＤＨ５，Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００为Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ产 感染和癌症等皆有重要意义 。ｍｉｃｒｏＲＮＡ调控基因表 α 达的功能与来源无关，因此，ｍｉｃｒｏＲＮＡ成为继ｓｉＲＮＡ之 品，质粒提取试剂盒为 ＴＩＡＮＧＥＮ产品，壮观霉素为 ［２］ Ｓｉｇｍａ产品，Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ，ＲＮＡｉｓｏＲｅａｇｅｎｔ，ＦＱＰＣＲ试 后ＲＮＡ干扰领域一种重要的研究手段和实验工具 。 剂盒及ＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅＦｒｅｅ）为ＴａＫａＲａ产品，引物由 　　ＮＢＳ１是 ＭＲＮ复合物 （ＭＲＥ１１／ＲＡＤ５０／ＮＢＳ１复 ＴａＫａＲａ设计合成，Ｈｅｌａ细胞株由中国医科大学细胞生 合物）中的重要基因，是 ＤＮＡ双链断裂修复中最重要 物教研室赠送，兔抗人 ＮＢＳ１（Ａｂ３４３）抗体为ＳＡＢ产 的一个参与者。近年来众多的研究表明它在肿瘤细胞 品，ａｃｔｉｎ鼠抗人单克隆抗体为 ＳａｎｔａＣｒｕｚ产品，ＨＲＰ β 的端粒长度保持及细胞生存维系中发挥着重要作用， （辣根过氧化物酶）标记的山羊抗鼠、抗兔的二抗为 它的过表达可以诱导转化和肿瘤发生，并与部分肿瘤 Ｓｉｇｍａ产品，硝酸纤维素膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅｍｅ