第二章免疫组织化学的基本理论与技术.ppt

第二章 免疫组织化学的基本理论与技术 一、免疫组织化学的基本理论 1 原理：免疫组织化学(Immunohistochemistry) 是利用抗原与抗体特异性结合的原理，使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 可在光镜和电镜水平观察细胞膜及细胞内某种抗原物质的存在，从而为研究生命大分子，特别是酶、蛋白质、激素及受体蛋白等在组织内分布、细胞内定位以及代谢状态等，提供了特异性强、灵敏度高而又直观化的原位分析细胞组成物质的手段。 2 免疫组织化学全过程包括: ⑴ 抗原提取 ⑵ 抗体制备 (博士德,华美,基因公司等购买) ⑶ 抗体标记 ⑷ 免疫染色 ⑸ 观察分析等过程 二、抗原与抗体 1.抗原 Ag 定义：是指能刺激机体产生免疫应答，并与相应的免疫产物（抗体）发生特异性结合的物质。 蛋白质：免疫原性最强； 多糖：免疫原性次之； 脂类和核酸：必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。 2.抗体 Ab 定义：是机体受到抗原刺激后，由免疫细胞合成并分泌出 一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白。 存在部位：主要存在于血清内。 分类：根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种， 即IgG、 IgD、IgE、IgA、IgM。 根据制备方法不同分为两种 即单克隆抗体与多克隆抗体 IgG的结构 IgG分子呈“Y”型由两条L链和两条H链组成。用木瓜酶水解IgG可得到3个片段：两个相同Fab段或抗原结合段和另一Fc段或可结晶段。在Fab段与Fc段之间有一个对酶敏感的区域，称铰链区。 单克隆抗体 Ag 三、免疫组织化学的基本技术 免疫组织化学技术是用标记物或显色物标记的抗原(或抗体)检测组织和细胞内的抗原，从而达到诊断或研究的目的。特定抗原(或抗体)的显示和定位是否准确与细胞和组织标本制各的质量好坏有着密切关系。因此，组织和细胞标本的取材和制备至关重要。 2．细胞标本制备 (1)印片法 应用：活检标本、手术切除的标本。 方法：将新鲜标本暴露病区,用载玻片轻压病区，脱落细胞粘附于载玻片上，立即浸入固定液中5-10min，取出后自然干燥，低温保存。 优点：简便省时，细胞抗原保存较好。 缺点：细胞分布不均、重叠,影响观察效果 (2) 穿刺吸取涂片法 应用：实质器官的病变区。 方法：①穿刺液较少时直接涂片,力求均匀。 ②穿刺液较多时，穿刺液滴入2毫升 Hanks液内，离心，制成细胞悬 液，吸一滴于载玻片上，轻涂， 干燥后固定。 优点：细胞均匀。 缺点：细胞易变形。 (3)体液沉淀涂片法 1) 细胞数较多，取一滴直接涂片。 2) 细胞数较少时，取5毫升自然沉淀液以1500rpm离心10min，弃上清，将沉淀涂片，略干后固定备用。 （4）体外培养细胞 1)贴壁生长的细胞：将盖玻片插入培养液中，让细胞自然贴壁于盖玻片上。 2)悬浮生长的细胞：可用离心涂片机法制成涂片。 （5）离心涂片机法 制成2×105-6／ml细胞悬液,取50～100μl，加入涂片机内，1000r／min, 2min，细胞即可均匀分布于载玻片上。 （二）免疫组织化学的固定方法 免疫组织化学固定的原则： 最好地保存细胞和组织的形态结构和最大限度地保存抗原的免疫活性。 方法： 一）固定有物理固定，如血涂片可采用空 气快速干燥、冻结干燥等； 二）化学固定 1．浸入法： 组织立即浸于固定液内,时间在2～12h之间。 2．灌注法： 插管由左心室插入主动脉,先用PBS冲洗血液,再 以泵或吊瓶灌注固定液。在灌注后30min内取材, 再置同一固定液内浸入固定l～3h。可使固定液 到达全身各处组织。 3．微波固定： 微波处理后,温度升高,分子运动加快,促进固定 液向组织内渗透,短时间达到固定效果。将标本 放入5～10ml固定液内,置于炉中央,周边放一烧 杯盛400纯水以吸收炉内产生的热量,选择强档照 射10～30s,照后固定液温度≤50℃。取出后,在 相同固定液内再固定2～6h(室温)。 （三）重要固定液 (1) 醛类固定剂: 为双功能交联剂, 可使组织间相互交联，将抗原保存于原位。特点是对组织的穿透性强，收缩性小.是常用固定剂。 1) 10％中性缓冲福尔马林：该固定剂易使组织硬化而致浸蜡困难，因此固定时间不宜过长。 2) 4％多聚甲醛磷酸缓冲液：适应性较广泛