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第十二章 荧光分析法 Ｆluorometry 特点： ★灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1~3个数量级； ★线性范围宽； ★选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外可见吸收的分子不一定发射荧光或磷光； ★应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发荧光。 基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法称为分子荧光光谱法。 荧光光谱法基本原理 分子的激发与失活 1. 分子的多重态 单重态 一个所有电子自旋都配对的分子的电子状态。大多数有机物分子的基态是单重态。当基态一对电子中的一个被激发到较高能级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于单重态。 三重态 有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态能量较激发单重态低。 激发光谱和荧光光谱 荧光量子产率Φ（荧光效率） 物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表示： 荧光与结构的关系 条件：强的紫外－可见吸收 　　　一定的荧光效率 （１）共轭效应 芳香族化合物的荧光最常见且最强，大多数未取代芳烃在溶液中发荧光，随着环的数目和稠合程度增加，荧光峰红移，Φ↑。简单杂环化合物不发荧光，但具有稠环结构的杂环化合物都发荧光。 （２）平面刚性结构效应 有刚性结构的分子容易发荧光，刚性和共平面性的增加有利于荧光发射。 荧光试剂 　　荧光胺：脂肪族和芳香族伯胺 　　邻苯二甲醛（OPA）：部分a氨基酸 　　丹酰氯：伯，仲胺及酚基的生物碱 　　测定无机离子的荧光试剂（表12-1） 荧光与环境因素的关系 ★温度降低会使荧光强度增大； ★带有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH有关； ★溶剂 溶剂极性增加有时会使荧光强度增加，荧光波长红移；若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变；含重原子的溶剂（碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱。 ★散射光　拉曼光有干扰干扰，选择适当的激发波长可消除拉曼光的 ★荧光熄灭剂 荧光熄灭（荧光猝灭）：荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象． 引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂： 　　卤素离子，重金属离子，氧分子，重氮化合物等 机制：１）与熄灭剂分子碰撞损失能量 　　　２）与熄灭剂分子作用形成不发光的配位化合物 　　　３）溶解氧使荧光物质氧化，或氧分子的顺磁性促进了体系间跨越 　　　４）浓度较大（＞１g/L）时，有自熄灭现象 1. 荧光强度与浓度的关系 F = K′（I0—I） I0——入射光辐射功率； I——透射光辐射功率；荧光量子产率（Ф）。 定量分析方法 １校正曲线法 2 比例法 荧光分析仪器 荧光分光光度计 荧光分光光度计既可用于定量分析，也可用于测绘激发光谱和荧光光谱。第一单色器选择激发光波长（＞250nm的紫外光），故称为激发单色器。第二单色器（荧光单色器）与激发光入射方向垂直，并选择荧光波长，可提高方法的选择性和准确度。 仪器的校正 灵敏度校正: 硫酸奎宁对照品溶液(1ug/ml) 波长校正: 汞灯的标准谱线对单色器波长刻度校正 激发光谱和荧光光谱的校正 * * 光致发光（Photoluminescence）: 荧光和磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时的发光现象，称为光致发光。 荧光(fluorescence):分子接受光子能量被激发后，从激发单重态的最低振动能级返回基态时发射的光． 2. 激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态。 无辐射跃迁 ☆振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。 ☆内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回到低能级的分子内过程。 ☆体系间跨越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。 ☆外转换：激发态分子与溶剂与其他溶质相互作用、能量转换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的减弱或消失，称为荧光熄灭（或猝灭）。 辐射跃迁: 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。寿命为10-8 ~ 10 -11s。由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，速率常数kf为106~109s-1。 磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。由于磷光的产生伴随自旋多重态的改变，辐射速度远小于荧光，磷光寿命为10-4 ~10s。 任何荧光化合物都具有两种特征光谱： 荧光激发光谱（吸收光谱） —固定某一发射波长，测定该波长下的荧光发射强度随激发波长变化所得的光谱。 荧光发射光谱（荧光光谱）——固定某一激发波长，测定荧光发射强度随发射波长变化得到的光谱。 荧光光谱的特点： ①斯托克斯位移（Stokes shift)。与激发光谱相比，荧光光谱的波长总是出现在更长的波长处； ②荧光光谱与激发波长无关