绿色荧光蛋白(GFP)研究进展.pdfVIP

维普资讯 第 14卷第 3期 ：7O 生 物 技 术 v01．14。No．3：70 2OO4年 6月 B10厄CHNo10GY Jun．2OO4 研究仅限于NMarnura等人利用鸟枪法得到了NK基因，并将 导后 ，表达的融合蛋白占菌体可溶性蛋白的26％[1。2OOO年 NK基因重组到 pUC19质粒上，转化到 E．eoliHBIO1受体菌中， 华南理工大学的黄志立等人LI4从纳豆杆菌中克隆了纳豆激酶 该基因工程菌发酵产物具有胞外蛋 白酶活性 ，但没有检测其 原基因，其基因序列与文献报道的核苷酸同源性达 99．08％。 溶栓活性。至于对纳豆激酶基因表达及表达产物的研究还未 重组到温控型表达载体 pBV220上，转化 E．coli咖 1O1中，实 见报道。但与纳豆激酶同源性很高的枯草杆菌蛋白酶 E和枯 现了在大肠杆菌中表达，表达产物的表达率达 12％，雨CLT法 草杆菌蛋 白酶 amylo~．eehariticus都 已有基因克隆的报道。 测定具有溶栓活性 ，lml菌液的溶栓活性相当于 120U尿激酶。 shimotoT等人利用穿梭质粒载体 pHY3OOPLK克隆amylo~eehar- 并研究了外源基因在大肠杆菌中的遗传稳定性，结果表 明，传 iticus基因，转化到四种不同的枯草杆菌中(ISW1214，11111， 代21代 ，外源基因的丢失率达 52％。2001年又报道 ．1，克 IA510，IA274)，发现转化菌株 (ISWl214／VrH1)的蛋白水解酶的 隆了纳豆激酶结构基 因，其基因序列与文献报道的核苷酸序 产率比宿主菌和基因供给菌分别提高20倍和4倍 (Yoehimoto 列完全相同，并将该基因重组到 p1’CzaA表达载体上，转化到 T，1988年)J。MarkL等人将枯草杆菌蛋 白酶 E基因克隆到 毕赤酵母GS115中，研究 了外源基因在真核表达系统酵母 中 穿梭载体 pBS42上，转化枯草杆菌，表达的丝氨酸蛋白酶活性 的遗传稳定性 ，结果表明，传代 120代，外源基因的丢失率仍为 是野生型的5倍 (MarkL，1984年)J。Wong等人通过质粒整 O％，可见，外源基因在酵母中具有很好的遗传稳定性。但没 合和噬菌体 pBS1转导绘制了枯草杆菌蛋 白酶 E基 因图谱。 有报道外源基因在酵母 中的表达情况。综上所述，我国学者 研究表明，克隆化的枯草杆菌蛋白酶基因只在静止生长期表 对纳豆激酶基因的克隆、表达及表达产物的活性方面进行 了 达 ，并且受 637启动子的控制 (Mll,rif1．Y，1984年)J。HTakagi 深入系统的研究，已经初步能够利用基因工程菌生产纳豆激 等人L8将枯草杆菌蛋 白酶 E基因克隆到嗜热表达载体上 ，实 酶样品。但是对于基因工程菌的下游工作一工程菌的发酵工 现了在嗜热杆菌中的表达。近年来 ，我 国掀起对纳豆激酶的 艺、表达产物的分离纯化工艺、表达产物的产量及收率方面仅 研究和开发热潮，纳豆激酶的药用价值 日益突出，我国学者渴 进行了一些探索性研究，要想实现利用基因工程菌工业化生 望利用基因工程菌生产纳豆激酶 ，致使对纳豆激酶基因的克 产纳豆激酶，还需更加深入地研究。 隆、表达、纯化及表达产物的产量和活性方面的研究取得了很 参考文献 ： 大进展。已经从不同菌株 (枯草杆菌 ，纳豆杆菌，解淀粉芽孢 [1]SumiH，HamadaH，TsushimaH，d ．Anovelfibrinolyticenzy~ (nattoki— 杆菌)中克隆了纳豆激酶成熟肽基因，包括前导肽和成熟肽的 tla8e)inthevegetablecheesenatto．Atypicalmdpo~Bls0)eanfoodinthe 纳豆激酶原基