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第五章 分子荧光光谱分析 第一节 荧光光谱法的基本原理 日常生活中的荧光现象:印染厂的废水在阳光下发 光、公路上的各种标志等。 分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )又称为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强度与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光光谱的形状和荧光峰对应的波长进行行的定性分析． 光致发光（Photoluminescence）: 荧光和磷光是分子吸光成为激发态分子，在返 回基态时的发光现象. 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最 低振动能级回到基态所发出的辐射。 磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到 基态所发出的辐射。 分子的多重态 单重态 一个所有电子自旋都配对的分子的电子 状态。大多数有机物分子的基态是单重态。 当基态一对电子中的一个被激发到较高能 级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于 单重态。 三重态 有两个电子的自旋不配对而平行的状态。 激发三重态能量较激发单重态低。 一、分子退激发的过程 激发态分子回基态的途径很多，速度最快的途径占优势。 1、振动驰豫 1）分子吸收光子后，可能被激发到激发态的各个 振动能级 2）通过碰撞（非辐射跃迁）到达同一激发态的最 低振动能级 需时间10-13—10-11sec，效率较高 2、荧光发射 分子从单重激发态的最低振动能级发射光子回到基态——荧光发射。 荧光光谱的波长比吸收光的波长大（长），这种现象叫作红移或斯托克斯位移。 3、内部转换 1）分子内过程，热退激 2）两个激发态重叠的能级发生内转换，因此吸收λ1、λ 2 两种波长的光后，都产生λ’ 2 的荧光。 4、外转换 激发态分子与溶剂或其它溶质间相互作用和能量 转换。 5、能系间交叉跃迁 电子自旋被反转，使分子的多重性发生变化 6、磷光 从三重态最低振动能级回到基态，放出磷光。 二、影响荧光强度的因素 1、荧光效率（荧光量子产率Φ） 物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表示： 高荧光分子Φf 1，无荧光分子Φf 0 2、影响荧光强度的因素 1）荧光与分子结构的关系 a、能吸收紫外可见光，有共轭双键，分子呈刚性、平面、多环结构，而且共轭平面越大、π电子共轭度越大， Φf越高。 b、取代基的影响 给电子基团使Φf增强，如-NH2、-OH 与π电子体系相互作用小的取代基对荧光影响小 高原子序数的原子引入π电子体系，使荧光减弱 吸电子基团，如：-COOH 、–NO2 、–N=O2、 卤素 使荧光熄灭。 刚性平面结构有利于荧光，因为刚性结构可以减少分子振动，减少能系交叉和碰撞退激。 2）温度和溶剂效应 温度升高， Φf下降 溶液黏度下降， Φf下降 不能使用含有重原子的溶剂 溶剂极性增加有时会使荧光强度增加，荧光波长红移；若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变。 3）pH值的影响 荧光物质的电离与非电离形式的Φf有差别，带有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH关； 4）溶解氧的影响 溶解氧的存在使Φf下降 第二节 荧光分光光度计 一、基本构造 1、光源 强度较高的氙灯或氙汞灯，要求有稳定的供电源。 2、单色器 两个，互成直角 3、样品池 四通杯 4、检测器 光电倍增管 二、仪器光路 第三节 荧光光谱法的基本参数及测量 一、荧光强度 根据朗伯-比尔定律 Ia=I0-I=I0(1-10-εbc) 则If=ΦfI0（1-10-kbc)=φI0(1-e-2.303k=bc) 对于稀溶液，kbc=A A＜0.05 If= 2.303 φf I0 kbc 当I0一定并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比 If= K·C K = 2.303 φ I0 kb) Cmax≈0.05/kb 当C超过Cmax 时，If—C偏离线性 溶液浓度太大，荧光分子之间及荧光分子与溶剂分子之间碰撞，发生非辐射跃迁，使荧光强度下降。 荧光自熄灭： C增大到一定程度，就会发生荧光自熄灭现象 荧光自吸收： 荧光荧光波长与激发光波长重叠时，荧光被吸收 二、激发光谱与发射光谱 激发光谱:固定发射波长(λEM),一般在最大发射位置