CTGF+siRNA质粒对UUO小鼠肾脏间质纤维化的影响.pdf

中 文 摘 要 CTGF siRNA 质粒对UUO 小鼠肾脏间质纤维化的影响 摘 要 目的：肾间质纤维化是多种肾脏疾病发展至终末期肾脏病的共同通 路。肾间质肌成纤维细胞（myofibroblast ，MyoF)是产生肾间质细胞外基 质(extracellular matrix，ECM) 的重要细胞。转化生长因子β1( TGF-β1)是公 认的致纤维化因子，它能诱导肾小管上皮细胞以肾小管上皮-肌成纤维细 胞转分化（tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation ，TEMT ）机 制活化，进而可以表达 α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin ， α-SMA) ，合成Ⅰ、Ⅳ型胶原（collagen Ⅰand IV ）、纤维结合蛋白（fibronectin， FN ）等细胞外基质成份，参与肾间质纤维化。α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA) 是肌成纤维细胞的特异性标志物，是一种细胞骨架蛋白。在正常肾脏组织 中除了血管平滑肌以外，很少表达a-SMA 。但肾间质纤维化时，肾间质细 胞胞浆、肾小管上皮细胞的基底侧，以及一些变性萎缩的小管上皮细胞胞 浆都可以表达a-SMA 。以Ⅰ型胶原为主的间质胶原，广泛存在于多种结缔 组织中，在肾脏纤维化疾病的发生和发展中，起着不可或缺的作用。其过 度表达是形成肾脏间质纤维化过程中的一个重要环节。结缔组织生长因子 （connective tissue growth factor ，CTGF ）是TGF-β促纤维化活性的下游 信号介质，刺激细胞增殖及细胞外基质的形成，在肾脏纤维化发生、发展 中有重要的作用。抑制CTGF 基因表达显然有助于延缓肾脏纤维化进程， 而应用常规抗纤维化药物抑制其表达的效果并不理想。RNAi 技术能抑制 靶基因的转录后表达，其作用类似于基因敲除。但基因表达并不是永远消 除，因而又被称为“基因沉默”。本研究利用单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral occlusion ，UUO)小鼠肾纤维化模型，采用尾静脉注射的方法整体 转染CTGF-siRNA 质粒抑制肾脏CTGF 的表达，观察敲低CTGF 表达对肾 脏间质纤维化的影响。 方法： 小鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型的制备及活体CTGF 基因转染 CD-1 雄性12 周小鼠随机分为3 组：假手术组（sham ）、UUO+ pBAsi mU6 Neo 质粒载体组（UUO+V ）和UUO+ pBAsi mU6 Neo CTGF siRNA 质 1 中 文 摘 要 粒组（UUO+ CTGF siRNA ），每组8 只小鼠。制备单侧输尿管梗阻（UUO ） 模型：水合氯醛(4 mg/kg)皮下注射使小鼠麻醉后局部剃毛，常规消毒铺孔 巾，选择腹正中线切口，依次切开皮肤至腹腔，游离肾脏及输尿管，将左 侧输尿管用组织钳托起中段部位，止血钳夹住，在两端用4.0 丝线两次结 扎左侧输尿管近肾盂段，剪断输尿管，然后连续缝合皮肤。假手术组手术 入路方式同 UUO 组，进腹腔后分离左输尿管但不结扎输尿管。UUO+ CTGF siRNA 组小鼠于术前 2 天和术后 3 天给予尾静脉快速注射 pBAsi mU6 Neo CTGF siRNA 质粒（1 mg/kg）；UUO +V 组用同种剂量和方法注 射pBAsi mU6 Neo 质粒载体。UUO 术后7 天每组取6 只小鼠，切取肾脏。 取部分肾皮质组织置于 4%多聚甲醛固定用于光镜观察及免疫组织化学染 色；部分肾皮质组织用于提取蛋白及 RNA 。免疫组织化学染色法检测 α-SMA 的表达；Western blot 检测CTGF 及α-SMA 的表达；半定量RT-PCR 检测α-SMA mRNA 的表达。 结果： ① Masson 染色结果显示：Sham 组小鼠1 周后肾组织中肾小球大小、 形态正常，肾间质、肾小管未见纤维增生改变。UUO+V 组小鼠 1 周后肾 间质、肾小管可见大量的胶原纤维增生。UUO+ CTGF siRNA 组结果：肾 间质、肾小