医学资料-流式表面染色步骤.docxVIP

淋巴组织细胞或培养细胞表面抗原流式检测步骤（一）细胞样品准备收集组织或细胞1. 取出目的组织（如:脾脏、淋巴结、胸腺、骨髓等），迅速浸泡在Cell Staining Buffer (BioLegend Cat. #420201)中，并应用研磨及过滤等方法制备成单细胞悬液；如果为体外培养细胞，直接用Cell Staining Buffer重悬细胞后进行下一步操作。2. 添加Cell Staining Buffer至约15mL，离心（350 x g）5分钟后弃去上清液。裂解红细胞（脾脏组织等）3. 如样品为脾脏组织细胞，需要裂解红细胞。把10X 红细胞裂解液(RBC Lysis Buffer ) (BioLegend Cat. #420301) 用去离子水稀释成1X工作液。然后用3 ml红细胞裂解工作液重悬细胞后，在冰上孵育5分钟。4. 加入10 ml Cell Staining Buffer到管中；离心（350 x g）5分钟后弃去上清液。5. 重复洗涤细胞一次（步骤2）。6. 用Cell Staining Buffer重悬细胞后计数，稀释细胞为5-10 x 106细胞/ml，然后每支流式检测管中加入100uL细胞悬液（5-10 x 105 细胞/管）。Fc受体封闭（可选）7. Fc受体的封闭过程是为了减少抗体的非特异性结合造成的影响；对于小鼠细胞的检测，BioLegend公司的纯化抗小鼠 CD16/CD32 抗体特异识别并结合Fcγ R III/II (Cat. #101302, clone 93)，适用于封闭抗体非特异染色；实验操作为用5-10 μg/ml纯化CD16/32抗体与细胞冰上孵育10分钟。而对于市面上没有可用的人或大鼠封闭抗体，可以采用加入无关纯化免疫球蛋白（如与所用荧光标记抗体相同种属和抗体亚型）到细胞样品中进行封闭。（二）细胞表面荧光染色步骤8. 在每个流式检测管中加入适量的预稀释好的一抗（荧光标记抗体、生物标记抗体或纯化抗体）；在空白管/孔或同型对照管/孔中加入与抗体相同量的对照试剂。然后各管避光冰浴或在4℃冰箱中孵育15-20分钟。（注：有些抗体可能需要更长的孵育时间，建议实验者进行预试验摸索）9. 加入至少2mL Cell Staining Buffer，然后350g离心5分钟后弃去上清液；重复洗涤过程两次。10.（间接标记）若使用的一抗是纯化或生物素标记抗体，则每管/孔加入适量稀释好的荧光标记二抗或荧光标记亲和素（SAv-PE, BioLegend Cat. # 405204）后于冰浴或在4℃冰箱中避光孵育15-20分钟。11. 重复洗涤细胞一次（按步骤9）。12. 用0.5 ml Cell Staining Buffer 重悬细胞；如有必要，加入10uL(0.25 μg)/million细胞的核染料7-AAD(BioLegend Cat. #420401)以区分活、死细胞，冰上孵育3-5分钟。（注：我们不建议7-AAD与PE-Cy5 或 PE-Cy7等荧光标记抗体联用）13.上机检测并分析结果。B．全血细胞表面抗原的流式检测步骤1.往含有100uL抗凝全血的流式检测管中加入适量的预稀释好的一抗（荧光标记抗体、生物标记抗体或纯化抗体）。2. 室温避光孵育15-20分钟。（注：有些结合能力较低的抗体可能需要更长的孵育时间，建议实验者进行预试验摸索）3.把10X 红细胞裂解液(RBC Lysis Buffer ) (BioLegend Cat. #420301) 用去离子水稀释成1X工作液，用之前恢复至室温。加入2 ml 红细胞裂解工作液到含全血/一抗的检测管中，室温孵育10分钟。4.350g离心5分钟后弃去上清液。5.加入至少2mL Cell Staining Buffer，然后350g离心5分钟后弃去上清液。6.（间接标记）若使用的一抗是纯化或生物素标记抗体，则每管/孔加入适量稀释好的荧光标记二抗或荧光标记亲和素（SAv-PE, BioLegend Cat. # 405204）后室温避光孵育15-20分钟。7.重复洗涤细胞一次（按步骤5）。8.用500ul Staining Buffer或500ul 2%的多聚甲醛固定液重悬细胞。9.上机检测并分析结果。