马铃薯α-淀粉酶基因和黑曲霉γ-淀粉酶基因的分子克隆及其在毕赤酵母菌中的表达.pdf

硕Ij 9：5f?i沦迁 摘要 传统的乙醇是利用粮食通过高温蒸煮发酵的I方法生产，考虑剑传统洒精发酵 工业高能耗、原料缺乏、高污染、发酵洒精度偏低等弊端。本实验选择了以，§铃 薯淀粉为发酵原料，生产乙醇符合国家节能减排的广：Hk政策。利用基凶操作技术 克隆了马铃薯来源的u．淀粉酶基冈以及具有黑曲霉来源的耐酸I耐高温1，．淀粉酶 桀冈，经体外构建后分别导入酵母菌，获得了可有效降解马铃薯淀粉的转堪[大l毕 赤酵母_L程菌，通过接种酿酒酵母厌氧发酵获得乙醇。 实验卞嘤研究结果如下： 1、以夏波蒂马铃薯总RNA为模极，根据0【．淀粉酶接I-大1保守I爱序列设汁合 224 其克隆至pET32a上进行测序，测序结果表明该基闪全长lbp，编码406个 氨基酸。通过生物信息学分析54—1 224bp为编码成熟肽基lXl，义设计j，引物克隆 转化毕赤酵母GSll 5，利用锥虫蓝法筛选获得高表达淀粉酶活性菌株GSamyA5， 学性质分析表明：该酶作用的最适pH值为6．0，最适作Hj温度为45℃，热稳定 Fe2+、Fe有抑制作用。 2、以黑曲霉总RNA为模板，根据丫．淀粉酶基冈保守区序列设计合成，引 至pET32a上进行测序，测序结果表明该基因全长I996bp，编码604个氨基酸。 5， 利用锥虫蓝法筛选获得高表达淀粉酶活住菌株GSamyC3，对该菌株进行培养， 该酶作用的最适pH值为4．6，最适作用温度为60℃，热稳定忤及抗酸碱一P卜良好， 用。 3、以马铃薯淀粉为原料，按l％接种量分别接种转q．淀粉酶鉴㈧和Y．淀粉 酶基斟酵母工程蔚，甲醇诱导表达36h后二次接种转Y．淀粉酶，琏|太I酵{江衔，冉添 加5％酿酒酵母进行厌氧发酵，生产洒精。考察j，不同发酵时间、发孵温度及接 种量刈马铃薯淀粉出洒率及水解率的影响，得出该发酵工艺最适条件为：接种量 5P ‘5铃曾(；c·沉帮)朐强H‘羊f1mi!iv一；定粉酌掣：H的分r’啦降砭疑布牛力j^}埘丽7f，的表i墨 为5％，最适温度为30℃，发酵时间为72小时，在该条件下产洒率分别为9．6％， 7．77％，9．75％。 关键词：马铃薯；黑曲霉；a．淀粉酶基因：1，．淀粉酶基因：酿酒酵母：毕赤酵母 GS115：基因表达 硕f学f÷i睑迁 曼量曼皇葛曼蔓篁曼曼曼曼曼曼曼!皇曼曼蔓!量曼曼曼皇曼舅喜舅曼曼曼曼皇皇曼皇曼曼皇鼍Ill-,,曼曼量曼曼曼曼曼璺舅皇曼!鼍曼苎罾 Abstract was traditionalof ethanol The high-temperatureboiling wayproducing through alcohol before the of traditional disadvantages fermentation．Considering as of of fermentationsuch original consumingenergy，lacking