鸭疫里氏杆菌CH3的TbdR1缺失株构建.pdfVIP

Ⅰ Ⅰ 摘要 摘要 摘摘要要 鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌（Riemerellaanatipestifer，RA）引起鸭、鹅、火鸡和其他 禽类的一种接触性传染病，最常见于鸭。鸭疫里氏杆菌病发病率高、死亡率高；即使耐受过病的 鸭，也因此影响生长速度，甚至形成僵鸭，给养殖业造成巨大的经济损失。目前人们对RA 的分 子致病机制等还知之甚少。 RA的GSM15868株的全基因组解析表明其基因组中含有31个编码TonB依赖受体的基因， 且它们之间的同源性很低，提示它们可能在RA和宿主的相互作用过程中起着重要的作用。前期 的研究表明，TonB依赖受体TbdR1是血清1型、2型和10型间的一种交叉免疫原性抗原。探究 TbdR1的生物学功能对了解RA的分子致病机制十分有意义。 本研究首先用基因克隆测序的方法分析了tbdR1基因在不同血清型RA 中的分布和同源性， 结果表明所有检测的RA 菌株菌均携带tbdR1，且其氨基酸同源性高达98.2%－100%。其高度保 守性提示该蛋白可能具有重要的生物学功能。 其次，采用接合转移的方法将重组性自杀质粒pDS132-LSR 导入RACH3株中，通过同源重 组以1119bp的壮观霉素抗性基因替代tbdR1基因ORF 中的2726bp片段，从而获得TbdR1 的基 因缺失株CH3ΔtbdR1。进一步将完整的TbdR1基因以及OmpA启动子克隆到E.coli－RA 穿梭表 达载体pRES 上，并将其回复到CH3ΔtbdR1中，从而获得此缺失突变株的互补菌株cCH3ΔtbdR1。 为了检验TbdR1基因在鸭疫里氏杆菌CH3 株中，对于铁离子的吸收中是否起着重要的作用， 用二吡啶(DIP) 螯合培养基中的铁离子，比较了RA 的野生CH3株、基因缺失株CH3ΔtbdR1和 互补菌株cCH3ΔtbdR1在低铁环境下的的生长繁殖情况，并在上述的培养基中加入不同形式的铁 离子（FeCl3 或Hemin），研究TbdR1对CH3株获铁的影响；利用结晶紫染色的方法比较三株细 菌的生物被膜形成能力是否具有差异；利用三株细菌黏附侵入Vero细胞的方法，比较它们对Vero 细胞的黏附与侵入能力；用动物攻毒试验比较三株细菌的LD ，血液、肝脏和脑组织中的细菌载 50 量，比较它们对雏鸭的致病性等方面的差异。结果表明，野生株CH3株和缺失株CH3ΔtbdR1在 含200µmol/L 铁离子螯合剂DIP 的TSB 中均不能生长繁殖；在上述培养基中添加FeCl3 后，野 生株CH3 和互补菌株能生长，而缺失株仍然不能，提示TbdR1在CH3株获铁过程起着重要的作 用。进一步的研究表明，TbdR1 与CH3 株获取Hemin 有关。tbdR1缺失显著降低了CH3 株的生 物被膜形成能力，以及对Vero细胞的黏附和侵入能力。 动物试验的结果显示，缺失株CH3ΔtbdR1对鸭的LD 比野生毒株CH3高 45倍。另外，缺 50 Ⅰ 失株CH3ΔtbdR1 在接种雏鸭后24h鸭血液、肝脏以及脑组织中的细菌载量与野生株相比显 著下降（p＜0.01）。 综上所述，研究的结果表明， TbdR1 在鸭疫里氏杆菌CH3株的获铁（如hemin）过程中起 着重要的作用，而且与CH3 株的致病性相关。因此，TbdR1 是鸭疫里氏杆菌的一个重要的毒力 因子。 关键词：鸭疫里氏杆菌，TonB依赖受体，获铁，致病性，缺失株 Ⅱ Abstract Abstract AAbbssttrraacctt Riemerella anatipestifer (RA) infection,