EppendorfRealMasterMixProbe一种新颖的探针法荧光定量PCR试剂.pdfVIP

文献参考 No. 3 TM Eppendorf RealMasterMix Probe 一种新颖的探针法荧光定量PCR试剂 前言 材料和方法 实时 PCR ，通过荧光报告分子对 PCR 反应起始模板进行精确定量，该方法 重复性： β- 已被广泛用于基因表达分析或病原体检测。选择在 PCR 扩增的指数增长期进行扩 2 微球蛋白基因模板的 96 次重复 增 DNA 分子的定量，是因为该时期对 PCR 反应的成分没有限制，并且避免了 扩增 PCR 后续分析步骤（如电泳）及引发污染的可能。实时 PCR 中使用的荧光报告分 设计一对引物和一条 FAM 标记的 子可以是不依赖模板的非序列特异性的染料或依赖模板的序列特异性荧光探针。 荧光探针用于从 50ng 人基因组 DNA 基于不同荧光报告分子的化学特性，需要与之相容的反应缓冲体系。 （Promega，USA）中扩增一段78bp 的β-2 微球蛋白基因（表 1）。分别用 Eppendorf 最新开发的针对荧光探针法的定量 PCR 反应试剂，独辟蹊径通过 Eppendorf RealMasterMix ProbeROX 优化 5 外切酶引发的荧光信号释放的最佳反应环境，它不同于市面上已有的定量 和市面上另一种常用的实时 PCR 试剂， PCR 试剂，它们往往只关注优化 Taq 酶的聚合能力及热启动酶的激活。此外， 设立两组相同模板的同步对照扩增实验 Eppendorf RealMasterMix Probe 定量试剂也充分降解了探针荧光淬灭基团的信 并分别重复 96 次。实验在 ABI 7000 号释放，经过上述优化，用相同量的模板将得到更强的信号。 SDS 型荧光定量 PCR 仪上进行。表2 示 PCR 反应体系，表 3 示热循环方案。 值得一提的是，考虑到提高实时 PCR 特异性的另一个重要的影响因素 —— 热启动 PCR，Eppendorf 将全新的热启动酶引入实时 PCR 试剂体系，即通过特有 灵敏度：单拷贝基因检测 的与 Taq 酶活性中心结构互补的抑制配体，该配体依一种可逆的、温度依赖的方 SRY 是在 Y 染色体上发现的单拷 式与 Taq 酶结合，通过这种方式实现的热启动无需初始的热激活过程，同时，由 贝基因，理论上，6pg 基因组 DNA可 于抑制配体与 Taq 酶结合是温控可逆的，因而使每个 PCR 循环均达到热启动冷终 以算作一个单拷贝基因。从统计的角 止的效果。由于该项独特的热启动技术，使 Eppendorf 的 RealMaste buffer 无需 度，每个样品可以包含或不包含单拷 专门为热启动而设立 pH 条件，从而使体系的 pH 环境更加有利于 Taq 酶发挥其 5 贝基因，但更多的样品往往包含多个 外切酶及聚合酶