腾冲嗜热杆菌热稳定海藻糖磷酸化酶的基因表达与酶的分子生物学性质研究枣.pdfVIP

中国科学 C辑 生命科学 2004，34(5)：409--415 腾冲嗜热杆菌热稳定海藻糖磷酸化酶的基因表达 与酶的分子生物学性质研究枣 任媛媛 戴秀玉 周 坚 刘景芳 裴华东 向 华 (中国科学院微生物研究所 微生物资源国家重点实验室，北京 100080) 摘要 分离克隆了腾冲嗜热杆菌(Thermoanaerobactertengcongensis)海藻糖磷酸化酶(TreP)的 编码基因(treP)，该酶可催化以葡萄糖和0c一1一磷酸葡萄糖为底物的海藻糖合成反应及其逆向的分 解反应．反向mRNA点杂交实验表明，腾冲嗜热杆菌中fP基因在高盐胁迫条件下表达量增加， 而在海藻糖诱导条件下表达量降低．将该基因导入不含 TreP 的大肠杆菌中进行诱导表达， SDS—PAGE表明，异源表达的TreP分子量约为90kD，与预期值相同．通过葡萄糖氧化酶法测定 分解产物葡萄糖的产率表明：TreP催化海藻糖分解反应的最适温度是70~C，最适pH值为7．0；通 过HPLC检测合成产物海藻糖的产率表明：TreP催化合成反应的最适温度为70~C，最适pH值为 6．0．在最适反应条件下，5O g的TreP粗酶可催化25mmol／L0c一1一磷酸葡萄糖与葡萄糖在30min 合成 11．6mmol／L海藻糖；而同量的酶在同样时间内仅能将 250mmol／L海藻糖分解生成 1．5 mmol／L葡萄糖．以上体内胁迫和诱导表达分析及体外酶学性质分析均证明该酶的主要功能是催 化海藻糖的合成反应．热稳定性实验表明，该酶性质比较稳定，在50~C下温育7h还能保持77％ 以上的活性，是一个有潜在工业用途的新的热稳定海藻糖合成酶． 关键词 基因表达 点杂交 腾冲嗜热杆菌 海藻糖磷酸化酶 海藻糖是一种由两个葡萄糖分子以 ．1，1糖苷键 性蛋白、生物膜、医药产品甚至待移植的器官，因此 连接的非还原性双糖，广泛分布于微生物、植物及昆 海藻糖生物合成途径的研究和利用已成为 目前的研 虫中，通常在环境胁迫条件下海藻糖作为一种相溶 究热点 ．在微生物中海藻糖主要有 3条生物合成途 性介质对生物大分子乃至生物体起保护作用I1,21，研 径，即由UDP一葡萄糖和 ．葡萄糖一6．磷酸合成海藻糖 究表明海藻糖是一种有效的保护剂，可以保护酶、活 的OtsA—OtsB途径，由l，4糖苷键连接的寡聚糖在分 2004．07．15收稿 国家 自然科学基金项 目(批准号和中国科学院重要方向项 目(批准号：KSCX2．SW．112)资助 联系人，E-mail：xiangh@sun．im．ac．cn，daixy@sun．im．ac．cn SCIENCEINCHINASer．CLifeSciences 4l0 中国科学 C辑 生命科学 第34卷 子内转糖基酶的作用下转变为 1，1糖苷键并进而水 藻糖至终浓度为0．2％ (w／v)，然后将3份样品继续在 解生成海藻糖的TreY-TreZ途径，以及由麦芽糖转变 70℃培养 1h，收集菌体，用TRIzol试剂分别提取上 为海藻糖的 TreS途径4【】．海藻糖磷酸化酶既能催化 述3份样品的总RNA． 海藻糖分解又能催化海藻糖合成，该反应的底物为 1．3 RNA标记和点杂交 葡萄糖和0c一1-磷酸葡萄糖，这是某些微生物在外界胁 为分析腾冲嗜热杆菌中艘P，ireS基因以及作为 迫环境下合成海藻糖的重要途径，并可能为工业上 酶法合成海藻糖提供新的途径3【]．就我们所知，目 对照的曲二糖磷酸化酶(TTE0798)基因(七 )在对照 组和处理组中的表达差异，我们针对3个基因分别设 前仅有几个 fP基因被克隆和鉴定，而且仅有