反转录引物的选择与Real-TimePCR引物设计的要求.pdfVIP

反转录引物的选择与Real-Time PCR 引物设计的要求 1）随机六聚体引物： 当特定mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA 。用此种方法时，体系中所有RNA 分子全部充当了cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA 中96%来源于rRNA 。 2）Oligo(dT)： 是一种仅对mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA 具有3端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA 可被转录。由于Poly(A+)RNA 只占总RNA 的1-4%， 故此种引物合成的cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的cDNA 在数量和复杂性方面均要小。特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA 可以多次 使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA 的表达水平。 3 ）特异性引物： 最特异的反转录方法是用含目标RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。用 此类引物仅产生所需要的cDNA ，导致更为特异的PCR 扩增。 做 Real Time PCR 时，用于SYBR Green I/Eva Green 法时的一对引物与一般PCR 的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求： ① Tm 55-65℃ ② GC 30-80% ③ PCR 扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp 之间都可。 ④ 引物的退火温度要高，一般要在 60℃以上。 要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA 污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显 子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA 污染的影响。 至于设计软件，PRIMER3 ，PRIMER5，PRIMER EXPRESS 都应该可以的。做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大 堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备寻找合适的引物非常不易。 五、cDNA 与引物质量检测 取0.2ml 薄壁PCR 管，编号。向各管中加入含染料2×PCR TaqMix10ul ；加入正反向引物各0.5ul （引物浓度10uM ） ，向管中加入混合的cDNA 各1ul 。各管补加水 至20ul 。 组份 加量 2×PCRTaqMix 10ul 10uMPrimer FW 0.5ul 10uMPrimer RV 0.5ul Template DNA 1ul ddH O 混匀至20ul 2 混匀，置于TP600PCR 仪中。95℃ 5min ；95℃15s，60℃35s ，40cycles ；72℃ 5min ；4 ℃ pause 。 取扩增产物各8μl ，DL2000 分子量标准5μl/泳道。1%琼脂糖凝胶120V 电压下电泳25min 。用凝胶紫外分析仪观察。 选择特异性好，扩增效率高的引物作为实时荧光使用引物。 六、利用相对定量的方法分析目的基因表达量的情况： 由于RNA 纯化后得率不同、RNA 反转录为cDNA 的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因 来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA 等。因此，在做 基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。 七、定量 PCR 检测： 取0.2ml 薄壁PCR 管，分别编号。向各管中加入2×qPCR TaqMix12.5ul ，10uM 各基因正反向引物混合物0.5ul ，对应的cDNA 各