表达牛轮状病毒VP7蛋白重组干酪乳杆菌构建及其免疫学初步分析.pdf

Abstract 摘 要 牛轮状病毒(Bovine rotavirus)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus) 。是引 起犊牛非细菌性腹泻的主要病原，牛轮状病毒主要感染15~40 日龄的犊牛，以厌食、呕吐、 腹泻、脱水和酸碱平衡紊乱为特征性症状。如继发牛冠状病毒和细菌感染，则死亡率则高达 80%，给养牛业造成很大经济损失。由于本病属于粪口途径传播的肠道传染性疾病。因此， 设计疫苗以刺激肠道黏膜免疫，阻断病原入侵的第一道防线，对科学防治本病具有重要意义。 本研究以干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393 作为递呈抗原的活菌载体，利用牛轮状病毒 主要免疫保护性抗原基因VP7 主要中和位点为靶基因，定向插入到干酪乳杆菌表面表达和分 泌型表达载体pPG- 1、pPG-2，构建了pPG-1-VP7/L.casei393 和pPG-2-VP7/L.casei393 重组乳 酸杆菌系统。以此作为口服制剂，通过乳酸杆菌表达和传递外源抗原以及乳酸杆菌本身黏附 定植作用，有效刺激机体肠道黏膜免疫系统，达到预防牛轮状病毒病目的。 实验从犊牛腹泻粪便中扩增获得了牛轮状病毒VP7 全基因，序列测定结果显示，该病毒 属 G6 血清型，属于牛轮状病毒感染的广泛流行株。实验首先使用大肠杆菌表达系统摸索并 验证VP7 基因在原核系统中表达的可能性及免疫效果。结果表明VP7 蛋白第51~254 位包含 VP7 蛋白主要抗原位点的基因片段得到了较好的表达。所制得的抗VP7 蛋白小鼠抗血清具有 较高的ELISA 效价 （1:6400 ）及中和抗体 （1:316 ）效价。在此基础上，构建了表达牛轮状病 毒 VP7 重组干酪乳杆菌表面表达系统了 pPG- 1-VP7/L.casei393 和分泌型表达系统 pPG-2-VP7/L.casei393 。经乳糖诱导后，对菌体裂解物和培养上清进行的western blot 检测表 明，pPG- 1-VP7/L.casei393 在菌体裂解物中检测到了目的蛋白，而 pPG-2-VP7/L.casei393 表达 系统在菌体裂解物和上清液中均检测到了目的蛋白的存在；间接免疫荧光试验证明，表达的 牛轮状病毒VP7 蛋白存在于菌体的表面。 为进一步鉴定重组菌是否可诱导机体的系统和黏膜免疫应答，本实验将小鼠共分为3 组， 9 每组10 只。口服免疫每只鼠2×10 CFU 活菌量，每隔14d 免疫一次，免疫三次，每次连续免 疫 3d 。免疫后于不同时间分别采集血清、粪便、外生殖道冲洗液样品，通过间接ELISA 测 定粪便、外生殖道冲洗液样品中特异性的sIgA 和血清IgG 水平，并通过细胞水平测定抗血清 对病毒的中和效价，以评价其免疫保护作用。 间接ELISA 检测结果表明，口服免疫重组干酪乳杆菌后在小鼠粪便、外生殖道冲洗液均 检测到了特异性sIgA，在小鼠血清中检测到了特异性的IgG 。免疫重组菌后，小鼠外生殖道 中sIgA 于免疫后14d 和37d、44d 抗体水平达到峰值，和对照组相比，差异显著（P ＜0.05）； 小鼠粪便中sIgA 在23d 和44d 抗体水平达到峰值，和对照组相比，差异显著（P＜0.05 ）；小 鼠血清IgG 水平在初次和再次免疫后未见抗体效价明显升高，三免后开始出现明显的上升趋 势，免疫后的44d 达到峰值（p ＜0.05 ），之后稍有回落。 中和试验结果表明，pPG- 1-VP7/L.casei393 组与 pPG-2-VP7/L.casei393 组在免疫后 48d 血清的抗体中和效价分别为1:62.9 和1:50.6。 以上结果说明本研究所构建的重组干酪乳杆菌表达系统能够诱导机体产生局部黏膜免 疫和系统免疫应答，并能诱导集体产生免疫保护作用。 关键词：牛轮状病毒；VP7 ；重组干酪乳杆菌；口服免疫 V 东北农业大学农学硕士学位论文 Construction of recombinant Lactobacillus Casei expression VP7 of Bovine Rotavirus and