ODD调节HSV-TK／GCV对乏氧环境宫颈癌Hela细胞特异杀伤作用的研究.pdfVIP

ODD 调节HSV-TK ／GCV 对乏氧环境宫颈癌Hela 细胞特异杀伤作用的研究1 1 1 1 2 1* 刘磊 ，方艳秋 ，许淑芬 ，严丽 ，谭岩 1.吉林大学第一医院中心实验室，长春（130021 ） 2.长春市中心血站，长春（130051 ） E-mail：bfcty@ 摘 要：目的 构建一种由氧依赖降解结构域（ODDD ）调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV-TK)基因表达的真核表达载体，观察ODDD 能否使HSV—TK ／GCV 系统对乏氧环境 中的宫颈癌Hela 细胞有特异杀伤作用。方法 RT-PCR 从Hela 细胞中钓取ODDD 片段，将 其克隆入荧光报告载体pEGFP-C1 ，构建pEGFP-ODDD ；扩增HSV—TK 基因，将其克隆入 pEGFP-ODDD 和pEGFP-C1 的下游，构建pEGFP-ODDD-TK 及pEGFP-TK 。将pEGFP-ODDD 转染入 Hela 细胞，流式细胞术检测在乏氧(O2 浓度为 1 ％)和常氧(O2 浓度为21 ％)条件下细 胞中EGFP 表达强度。以GCV 处理转染pEGFP-ODDD-TK 或pEGFP-TK 的Hela 细胞，MTT 法检测GCV 对培养细胞的杀伤效果。结果 经酶切分析、PCR 和DNA 序列测定证实，构建 了含有ODDD 序列调控的 HSV-TK 真核表达载体；含有 ODDD 片段荧光报告载体的Hela 细胞在常氧浓度下EGFP 的表达量为11.96 ％低于乏氧条件下的39.92 ％；在乏氧环境下，转 染 pEGFP-ODDD-TK 的 Hela 细胞对 GCV 的敏感性高于常氧含量组(P0.01) ，而转染 pEGFP-TK 的Hela 细胞在常氧和乏氧条件下对GCV 的敏感度基本相同。结论 构建了含有 ODDD 序列调控的HSV-TK 真核表达载体；常氧环境下，ODDD 使报告基因EGFP 表达降 低。ODDD 能特异发挥HSV-TK/GCV 系统对乏氧环境Hela 细胞的杀伤作用。 关键词：缺氧，Hela 细胞，氧依赖降解结构域，单纯疱疹病毒胸苷激酶，绿色荧光蛋白 中图分类号 R733 文献标识码 A 1. 引言 宫颈癌是最常见的女性生殖系统肿瘤，顺铂是治疗宫颈癌最常用的抗癌药。顺铂有副 作用，且肿瘤细胞常常产生耐受，限制其临床应用。研究发现，恶性实体肿瘤中心常常乏氧， 乏氧是降低肿瘤细胞对放疗、化疗的敏感性的重要原因。HIF-1 (低氧诱导因子-1)是一种由α 和β两个亚基组成的参与调控60 多种基因表达的核转录因子，对于维持肿瘤细胞在缺氧微 环境下的能量代谢、新血管生成、促进肿瘤增殖和转移起重要作用。HIF-1α 分子在缺氧组 织中的特异表达受其分子中一种氧依赖降解结构域（oxygen dependent degradation domain, ODDD ）特异调控。本研究拟构建由 ODDD 调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase ，HSV—TK)表达的真核表达载体，观察ODDD 能否特异发挥在HSV －TK ／GCV 系统中对缺氧环境下人宫颈癌 Hela 细胞的杀伤作用，探索弥补肿瘤放、化疗 的不足及增强其疗效的方法。 2. 材料和方法 1.1 材料 宫颈癌细胞株Hela（本实验室传代培养），大肠杆菌菌株Ecoli DH5α 、质粒pEGFP-C1(本 实验室保存) 。TK 基因来源于pHSV106 (购自东方试剂公司) 。pGEM-T easy 质粒、T4 连接 酶（Promega ），限制性核酸内切酶Sal Ⅰ，BamHI 、Xba I(购于大连Takara 公司) 。 本课题得到吉林省科技厅国际合作项目（项目编号20 ）的资助。