16S+rRNA序列分析在多杀巴斯德氏菌鉴定中的应用.pdfVIP

第26卷第6期 实验动物科学 V01．26No．6 2009年12月 L^BORAl’0RYANIMALSCIENCE December2009 16S rRNA序列分析在多杀巴斯德氏茵鉴定中的应用* 高正琴1 张 强2 贺争鸣1 岳秉飞1 (1．中国药品生物制品检定所，北京1000so) (2．首都医科大学附属北京佑安医院，北京100069) 摘要：目的应用16srRNA序列分析方法，对多杀巴斯德氏菌进行鉴定。方法采集猝死家兔样本，进行病理组织 学检查和病原菌分离培养。针对细菌16SrRNA基因保守区序列设计一对引物，以分离菌株抽提的DNA为模板，进 行PCR扩增及16SrRNA序列分析。结果从死亡家兔肺脏中分离鉴定出了一株多杀巴斯德氏菌(PMr0901)。将分 16S rRNA核苷酸同源性大于99％。分离菌株对阿莫西林／克拉维酸、头孢曲松、左氧沙星、四环素敏感，而对青霉素 16s G已产生耐药性。结论 rRNA序列分析的分子生物学方法可用于病原菌的鉴定。 关键词：16SrRNA；多杀巴斯德氏菌；鉴定 文献标识码：A 文章编号：1006—6179(2009)06．0001．05 中图分类号：Q93．337 16SrRNA基因存在于细菌及衣原体、立克次基因序列与形态学方法相结合，对细菌进行系统分 体、支原体、螺旋体、放线菌等原核生物的染色体基 类，用于临床致病菌的检测鉴定‘1圳。 因中，不存在于病毒、真菌等非原核生物体内。有细 2009年6月，作者对临床猝死的家兔进行了细 菌“分子化石”之称的16SrRNA在其碱基组成、核苷菌学检查和病理学诊断，利用16SrRNA序列分析技 酸序列、高级结构及生物功能等方面表现出进化上 术对多杀巴斯德菌分离菌株进行了鉴定。 的高度保守性。这种进化与保守的二重性，使其成 为目前微生物系统分类研究中最有用和最常用的 1材料和方法 “分子计时钟”。16SrRNA具有以下特点：多信息 (其基因核苷酸序列具有高度保守性：同一科、属、种 1．1培养基和试剂 间细菌16SrRNA基因同源性达94％一97％以上，但微厌氧培养系统由日本三菱瓦斯化学株式会社 其保守性又是相对的，在保守区之间存在9。10个 提供。血琼脂培养基、水解酪蛋白血琼脂培养基 变异区，不同科、种、属间都具有一定的变异，序列变 (MHA琼脂)、MH肉汤、葡萄糖、硝酸盐、尿素等生化 Broth 化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高)、多 反应培养基，由本所培养基室提供。Nutrient 拷贝(每个细菌约含5～10个拷贝，这使得对该基因No．2为英国OXOID公司产品。药敏纸片购自北京 500 的检测具有敏感性)、大小适中(约l bp，便于序 天坛药物生物技术开发公司。dNTP 列测定分析比对)。16SrRNA编码基因的这些特点EX 使之成为较理想的细菌基因分类的靶序列，逐渐成 纯化试剂盒为大连宝生物工程有限公司产品。 为细菌鉴别、分类的金标准。随着基因组学的迅猛 1．2剖检变化 发展，几乎所有病原菌的16SrRNA基因测序均已完 家兔的气管黏膜充血、出血，气管内有大量血色 成，其对16SrRNA基因序列的分析，适用于确定属泡沫状物充斥；胸腔内有血样渗出液；淋巴结和脾脏 rRNA 及以上分类单位的亲缘关系。目前常将16S 肿大、出血；肺水肿、充血、出血；肝肿大、变性，有许 收稿日期：2009—09—28 ’基金项目：北京市科委公益应用项目(D07080200720701) 作者简