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分子生物学研究方法基因克隆技术 2008-06-05 20:11 论文主要内容摘要： 1.重组DNA分子的构建： 2.克隆载体及其主要功能 4.重组克隆鉴定 在当今生命科学的各个研究领域中，分子克隆技术通常特指基因克隆或DNA重组 技术。基因克隆主要包括：①连接外源基因和克隆载体，构建重组DNA分子，② 将重组DNA分子转入受体细胞，使外源基因随受体细胞分裂而得以复制、繁殖。 基因克隆的基本方法 一个典型的基因克隆实验，主要包括以下步骤： （1）包括有目的基因在内的DNA片断插入另一个DNA分子，形成重组DNA分子。 （2）重组DNA分子通过转化或其他类似的方法被导入受体细胞。大肠杆菌是使 用较多的受体细胞。 （3）在受体细胞中，克隆载体指导重组 DNA分子复制，产生许多完全相同的拷 贝。 （4）当受体细胞分裂时，重组 DNA分子的拷贝进入子细胞，克隆载体的复制将 在子细胞中继续。 （5）大量分裂的受体细胞形成克隆：一个细胞群体，其中每个细胞都含有许多 重组DNA分子的拷贝。 １.重组 DNA 分子的构建 构建重组DNA分子是基因克隆实验的第一步，亦即，把环状的载体在指定部 位切断，然后把含目的基因的DNA分子插入其中，再将两者连接起来。这一过程 需要两种DNA操作酶：限制性内切酶和连接酶。限制性内切酶能够识别DNA分子上 的特定核苷酸序列，并在该处特异性切断DNA分子。许多限制性内切酶的识别位 点是6个核苷酸，但是，也有识别4个或5个、甚至8个核苷酸顺序的限制性内 切酶。经限制性内切酶处理后的DNA分子断端有两种：平端和粘端，它们的性质 对基因克隆的实验设计有重要影响。其中，具有不同识别位点的限制性内切酶可 以产生相同的粘端。DNA分子片断通过粘端形成的碱基互补并不能使之相互连接， 后一过程需要连接酶的催化作用。所有生物细胞中都产生连接酶，但是，基因克 隆中最常用的是T 噬菌体的连接酶。连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯 4 键。由于平端不能使DNA片断保持相互接近的位置，因而，和粘端相比，连接酶 对平端DNA分子之间连接反应的催化效率较差。 ２.克隆载体及其主要功能 载体是克隆基因的关键组分，载体使重组DNA分子能够在受体细胞中复制。 质粒和噬菌体是两种天然的DNA载体。目前，能在不同受体细胞中使用的载体有 数百种，其中，可以在大肠杆菌中使用的载体数目最多。 质粒pBR322是一种典型的大肠杆菌克隆载体，它全长仅为 4.3kb。pBR322 带有两种抗生素抗性基因：b -内酰胺酶基因和四环素抗性基因，前者修饰并消 除氨苄青霉素对大肠杆菌的毒性。通常，目的基因插入载体质粒将破坏四环素抗 性功能。因此，使用含有氨苄青霉素和四环素的培养基，我们可以鉴别大肠杆菌 的转化细胞：带有重组质粒的转化细胞只能在含氨苄青霉素、不含四环素的培养 基上生长；另一方面，原受体细胞不能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生 长；而有载体质粒但没有目的基因的转化细胞能在含有氨苄青霉素和四环素的培 养基上生长。另外，pBR322是一种松弛型质粒，在培养液中加入氯霉素可以使 转化细胞中的质粒拷贝数由通常的15个增至1000-3000个，此间，大肠杆菌的 染色体并不复制。 在细菌中，噬菌体载体是另外一类常用的克隆载体。和质粒不同的是，噬菌 体载体通过感染过程即转导进入宿主大肠杆菌细胞。通常，作为克隆载体的噬菌 体，都经过一定的突变和缺失处理。因此，这类噬菌体进入大肠杆菌细胞之后， 并不像一般噬菌体那样在宿主染色体上整合，而是直接进入裂解周期：大量复制 噬菌体、裂解宿主细胞，最终在培养基上形成含有大量噬菌体拷贝的噬菌斑。 和质粒载体相比，噬菌体载体能够克隆更长的 DNA片断。 3.重组克隆筛选 3.1.抗性基因插入失活筛选法 根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法是重组体常用的筛选方 法。如非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的, 表型为AprTcr。带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗 性平板上生长。但是, 如果在该质粒的四环素抗性基因内插入外援片段, 就会造 成四环素抗性基因失活, 变成AprTcs, 携带这种质粒的宿主菌可以在氨苄青霉 素的平板上生长, 而不能在四环素抗性平板上生长。 3.2. 蓝白斑筛选法 根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法需要进行菌落平板的影 印复制, 才能