FQ-PCR法检测外周血单个核细胞内HCVRNA含量的相关实验条件分析.pdfVIP

FQ-PCR 法检测外周血单个核细胞内HCVRNA 含量 的相关实验条件分析1 1 2 2 2 2 2 钟华平 ，赵伟 *，沈玲 ，薛蓉 ，吴引伟 ，殷艳天 1. 东南大学医学院，南京（210003 ） 2. 东南大学附属南京市第二医院，南京（210003 ） E-mail ：zhonghuapingseu@126.com 摘 要：目的 对采用实时荧光定量 PCR （FQ-PCR ）法检测外周血单个核细胞内（PBMC ） HCVRNA 含量过程中洗涤细胞的方法及标本保存的条件进行探索。方法分别于同 1 天内收 集分离 6 例（A 组）和 11 例（B 组）血清 HCVRNA 阳性慢性丙型肝炎患者PBMC ，A 组 分别采用常规法及改良法即在第 2 次离心前加入 10g/LRNA 酶 50µl 处理 15 分钟洗涤细胞 5 次，并留取每次洗涤液及细胞；B 组采用改良法洗涤细胞 3 次后并把细胞分成 2 份，分别作 为新鲜组和-20℃冻存组，然后采用离心柱型 RNA 提取法和 FQ-PCR 检测洗涤液和细胞中 HCVRNA 含量。结果①洗涤完 3 次时，常规法有 1 份洗涤液 HCV 为阳性，改良法均为阴 性；与第 1 次洗涤液相比，改良法再洗涤 1 次的病毒含量下降幅度明显高于常规法；②新鲜 组与冻存组 HCVRNA 含量不存在明显差异，SpearmanS 相关系数为 0.93 ，P ＜0.01 结论 洗 涤 PBMC 以采用改良法洗涤 3 次为宜；-20℃简易冻存 6 周的 PBMC 标本仍可用于 FQ-PCR 检测。 关键词：实时荧光定量PCR ，外周血单个核细胞，丙型肝炎病毒 外周血单个核细胞（PBMC ）中HCVRNA 含量不仅可以作为独立预测 IFN 疗效的指标 之一，而且还是干扰素治疗后复发的监测指标之一[1～3] 。然而，其检测结果的可靠性和准确 性一直存在争议[4], 即一方面在待检PBMC 样品中检测到HCVRNA 可能来源于样品洗涤过 程中残存血清 HCVRNA 而出现假阳性；另一方面细胞内 HCV RNA 在标本保存和核酸提取 过程容易被污染的 RNA 酶所降解出现假阴性，使检测结果偏低，因而限制了其在临床的广 泛应用。为此，作者采用高效率的离心柱型 RNA 提取技术和灵敏准确的 FQ-PCR 对相关实 验条件进行探索，现报道如下： 1 材料与方法 1.1 标本来源与采集 分别于同 1 天内从 6 例（A 组）和 11 例（B 组）南京市第二医院门诊的已多次检测证 实血清 HCVRNA 阳性慢性丙型肝炎患者采集 10%EDTA （高压灭菌）抗凝血10ml,立即分离 PBMC 。 1.2 PBMC 的处理 1.2.1 A 组 按常规方法分离PBMC ，将收获细胞液等分 2 份后, 分别用 0.9%生理盐水（NS ） 按常规方法和改良方法洗涤。常规洗涤法: 每次洗涤液 15ml , 充分吹打混匀细胞悬液后, 1500 转离心 10 分钟, 重复操作 5 次。改良洗涤法: 在第 2 次离心前参照文献[5] 的方法加 入 RNA 酶(10g/L，美国Promega 公司产品)50µl 处理 15 分钟后, 再次离心洗涤 4 次；收集每 次离心洗涤上清液各 500µl 和 1mlNS 重悬细胞液进行 HCVRNA FQ-PCR 检测。 1本课题得到江苏省医学领军人才基金项目的资助。 - 1 - 1.2.2 B 组 按实验结果 2.1 和 2.2 所确定的在常规洗涤 3 次基础上插入RNA 酶处理PBMC 并把所获取的 1ml 含小牛血清+DMSO 重悬细胞液等分成 2 份，1 份立即进行 RNA 提取和 HCVRN