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Primer-BLAST：NCBI 的引物设计和特异性检验工具 Posted on 11 六月 2009 by 柳城 ，阅读 6,254 Primer-Blast 介绍 Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。 Primer-BLAST 可以直接从 Blast 主页（/）找 到，或是直接用下面的链接进入： /tools/primer-blast/ 这个工具整合了目前流行的 Primer3 软件，再加上 NCBI 的 Blast 进行引物特异 性的验证。Primer-BLAST 免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好 的引物程序直接用Blast 进行引物特异性验 证。并且，Primer-BLAST 能设计出 只扩增某一特定剪接变异体基因的引物 –an important feature for PCR protocols measuring tissue specific expression （注：没办法准确的翻译， 只好作罢，汗！）。Primer-BLAST 有许多改进的功能，这样在选择引物方面比 单个的用 Primer3 和 NCBI BLAST 更加准确。 Primer-BLAST 的输入 Primer-BLAST 界面包括了 Primer3 和 BLAST 的功能。提交的界面主要包括三个 部分：target template （模板区）, the primers （引物区）, 和 specificity check（特异性验证区）。跟其它的BLAST 一样，点击底部的 “Advanced parameters” 有更多的参数设置。 模板（Template） 在 “PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA 格式或直接用 Accession Number。如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。Primer-BLAST 就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在 specificity check 区选择）是唯一的。 引物（Primers） 如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。可以在 Primer Parameters 区填入你的一条或一对引物。并且选择好验证的目标数据库（在 specificity check 区选择）。根据需要可设置产物的大小，Tm 值等。 特异性（Specificity） 在 specificity check 区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这 一步是比较重要的。这里提供了 4 种数据库：RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome (all chromosomes), and nr (the standard non-redundant database)。前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给 出更准确的结果。特别是，当你用NCBI 的 参考序列作为模板和参考序列数据库 作为标准来设计引物时，Primer-BLAST 可以设计出只扩增某一特定剪接变异体 基因的特异引物。selected reference assemblies 包括以下的物种： human, chimpanzee, mouse, rat, cow, dog, chicken, zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, 和 rice。Nr 数据库覆盖 NCBI 所有的物种。 实例分析 用人尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (uracil-DNA glycosylase genes, UNG, GeneID: 7374) 的两个转录本序列作为一个例子来分析。UNG1 的序列长一点（NM_003362），UNG2 的序列短一点（NM_080911，注：拿这两个基因的序列ClustalW 一 下就可以了）。 这里用 UNG2 的序列设计引物，选择RefSeq mRNA database，物种是Human，其 它默认。结果如下图 A-B 所示，设计的引物只能扩增出 UNG2。看上面的图，把 “Allow primer to amplify mRNA splice variants”这个选项给勾上，出现的 结果如下图-C 所示，新的引物也可以扩增出 UNG1 （注：我试了一下，不能得到 预期的结果，可能参数没设对）。 Figure. Primer-BLAST results for UNG transcript variant 2. The NCBI Reference sequence NM_08091