突触结合蛋白ICA结构域的两种膜结合状态的2及C2引发的插膜a+.pdfVIP

讲 学 屯 权 第48卷第14期 2003年7月 简 手匣 突触结合蛋 白I的C2A结构域的两种膜结合状态 及 Ca2+引发的插膜 贺雨虹 李湘辉 王 福 薛 毅 隋森芳 (清华大学生物科学与技术系，生物膜和膜生物工程 国家重点实验室，北京 1Ox【】84．联系人，E-mail：suisf@mail．tsinghua．edu．cn) 摘要 突触结合蛋 白(synaptotagmin)I是神经细胞突触囊泡上的一个膜整合蛋 白，C2A是它的具有重要 功能的近膜胞质片段．近年来的研究表 明，突触结合蛋 白I在 caz+引发的神经递质陕速释放过程中起 到 ca 感受器 的作用，而 C2A 结构域与神经细胞 的突触前膜 的相互作用与其caz+感受器 的功能密切相 关，但是其作用机制还不清楚．利用气／液单层膜技术结合表面密度的测量，发现 C2A 存在两种膜结合 状态：无ca 时，以静 电作用力为主的表面吸附状态；有ca2+时，静 电力起部分作用 的插膜状态．两种 状态时C2A都倾 向于与带负电荷，如磷脂酰丝氨酸 的磷脂膜结合．将C2A转染表达在PC12和HEK．293 细胞 中，利用免疫染色和 Westernblot检测也表明，C2A在有无ca2+存在 的情况下都主要存在于膜附近． 实验结果提示，突触结合蛋 白I作为 ca2+感受器的可能分子机制：突触结合蛋 白I的C2A 的表面吸附 功能在囊泡锚定或活化时协助囊泡附着在活化 区，当细胞 内Ca2+浓度迅速增加，C2ACa2+依赖的插入负 电荷膜的特点可以将囊泡拉近突触前膜，加之 同时和其他蛋 白，如SNARE复合物的作用引发膜 的融合． 关键词 突触结合蛋 白 l 磷脂单层膜 临界插膜压 免疫染色 Westernblot 神经递质 的释放是神经系统信号传递 中的关键 非常保守 的结构 ．每个 c2结构域折叠成紧密的八链B． 环节之一．神经递质 的释放是 由caz+引发的，由含神 三明治结构，3个柔韧的环从结构域的顶端伸 出，其中 经递质的突触囊泡与突触前膜融合完成 ．在过去的 的 2个形成一个 口袋，ca2+就结合于此Im】．在具有 c2 几十年里 ，寻找释放过程 中能感受 can的变化 的关 结构域 的一组蛋 白中，C2结构域经常作为和膜结合的 键蛋 白一直成为人们研究 的热点．目前公认突触结 部位 ．而近来的研究表 明，C2A 结构域与磷脂膜 的相 合蛋 白(synaptotagmin，syt)家族的蛋 白在调节囊泡融 互作用对于胞吐是十分重要的I”．我们的实验利用气 ／ 合 中起 ca感受器的作用 [1】． 液单层膜技术结合细胞系统，研究在有无 ca 的条件 突触结合蛋 白是存在于神经和 内分泌细胞的大的 下 C2A 和磷脂膜作用的特点，来深入探讨 sytI作为 分泌囊泡上 的一类跨膜蛋白，它是囊泡膜 的重要组成 can感受器在囊泡融合 中的可能的分子机制． 成分之一，占囊泡总蛋 白量 的 7％ ～8％，它由一个短 的位于囊泡 内的N．末端 、一个单链 的跨膜区和一个长 1 材料和方法 的胞质区组成．突触结合蛋 白I(sytI)是其 中最有代 (i)材料与试剂 ． PC，PS，DOPS和 DOPC从 表性的一个 4【】．它是 由 Matthew 等人 [5利用单克隆抗 SigmaChemical公司(美 国)购买．谷胱甘肽．琼脂糖凝 体在突触囊泡上发现的，之后的研究表 明，它在突触 胶 4B 亲和树脂 和凝血酶从 Amersham Pharmacia 囊泡的外吐过程 中起作用 ．果蝇 、线虫和小 鼠svtI基 Biochech公司购买．PC4．0His／Max为清华大学段 明 因敲除实验证 明，sytI对于快速 、同步 的Ca 引发的 星老师惠赠 ．质粒 pGEX．2T(含 C2