真核表达载体pcDNA3.1(+)-GFP-M2的构建及在小鼠骨髓树突状细胞中的表达.pdfVIP

药 物 生 物 技 术 PharmaceuticalBiotechnology 2014，21(4)：283—286 283 · 研究论文 · 真核表达载体 pcDNA3．1(+)一GFP—M2的构建及 在小 鼠骨髓树突状细胞中的表达 曹荣月 ，孙 翁 ，陈 檬 ，杨梦琪 ，宦晓军 ，肖 芳 ，李 盼，龙 军 (1．中国药科大学 生命科学与技术学院微基因药物实验室，江苏南京210009；2．南京中医药大学，江苏 南京210023) 摘 要 为 了构建含有绿色荧光蛋 白(Greenfluorescentprotein，GFP)报 告基 因的M2真核表达载体 pcDNA3．1(+)．GFP-M2(2段热休克蛋白70表位序列407—426，mHSP704o7 ，M2)，探讨M2基因转染小鼠骨髓树 突状细胞(Dendriticcell，DC)的表达情况。采用4轮PCR方法从 pcDNA3．1(+)一GFP载体中将GFP编码序列扩 增出来 ，并在其上游引入 Kozak序列 ，下游引入M2序列，使用限制性内切酶蹦ndlII和 BamHI将 目的片段插入到 pcDNA3．1(十)中，利用质粒自带的氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，获得重组基因的表达载体。重组载体通过 转染试剂Lipofectamine@2000转染至DC中，通过倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在细胞 内的表达。构建的 peDNA3．1(+)．GFP．M2经双酶切、PCR和测序鉴定和预期结果一致。荧光显微镜观察显示在转染 pcDNA3．1 (+)．GFP—M2基因的树突状细胞中，荧光均匀地分布于整个细胞。成功构建含有绿色荧光蛋 白报告基因的M2 真核表达载体pcDNA3．1(+)．GFP．M2。M2基因成功转染至树突状细胞中。 关键词 真核表达载体；基因转染；树突状细胞；mHSP70~一 ；绿色荧光蛋白；Kozak序列 中图分类号 Q812 文献标志码 A 文章编号 1005—8915(2014)04-0283—04 树突状细胞 (Dendriticcells，DC)由Steinman于 1937年 因子(CCR7~s-63，CCR5 ))来促进 DC的成熟 ，CD80是 DC 首次发现 』，是 目前所知体内最重要的专职抗原提呈细胞 成熟后表面主要的标志分子，而CCR7的上调则加强了DC (Antigenpresentingcell，APC)，并是唯一能激活初始性T细 成熟后向淋巴结的迁移能力。同时作为 CIMOL类似物，发 胞的抗原提呈细胞。未成熟的DC有较强的抗原捕获能 挥CD40L样作用，诱导 DC细胞的分化与成熟 。这种变 力，但也可以诱导 T细胞耐受，只有成熟的DC才能递呈抗 化更利于DC的交叉呈递和CTL的激活。实验室前期研究 原。当成熟的DC摄取肿瘤抗原后将抗原与主要组织相容 发现 ，将该段序列2次重复后(M2)，具有强大的抗肿瘤 性复合体 (Majorhistocompatibilitycomplex，MHC)结合，MHC 活性。然而关于M2在促进DC成熟的具体机理尚不明确。 将肿瘤抗原递呈到DC细胞表面使肿瘤抗原与原初 T细胞 绿色荧光蛋 白分子质量小 ，对宿主细胞无毒 ，稳定性 上的T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)结合，从而诱导初始性 好 、在细胞中高效表达及易于检测，可方便地直接观察生活 T细胞活化扩增分化为成熟活化的T细胞 。然而，在肿瘤 条件下的细胞等优点，已经成为对活体细胞进行分子生物 患者或荷瘤小鼠体内，DC往往是未成熟的，而且数量稀少 ， 学研究的有力工具 。因此 ，本课题通过构建以绿色荧光 因此如何获得大量成熟的DC，是进行肿瘤免疫治疗的关键。 蛋白为报告基因并含有 Kozak序列和 M2的真核表达载体 选择合适的成熟刺激剂对提高DC疫苗抗肿瘤免疫反 pcDNA3．1(+)一GFP—M2，并通过转染试剂 Lipofectamine 应起着关键的作用。一些研究表明，来源于微生物来源的 2000转染至DC中，为进一步研究M2与 DC免疫功能的 热休克蛋白7O第407到426