两种不同胞内pH敏感染料在激光扫描共聚焦显微镜中的应用.pdfVIP

ISSNIO07—8738细胞与分子免疫学杂志 (ChinJCellMolImmuno1)2009，25(6 559 · 论著 · 文章编号：1007—8738(2009)06—0559—03 两种不同胞 内pH敏感染料在激光扫描共聚焦显微镜中的应用 张国萍 ，吴丁兰 ，党 华 ，李 盛 (rtlm大学 ：生命科学学院实验中心，广东 广州510275；。第一附属医院黄埔院区，广东 广州510700) [摘 要] 目的：使用两种胞 内pH敏感的荧光染料 SNARF一 态记录会造成实验的不稳定性。而使用单激双发射 4F／AM和BCECF／AM，利用激光扫描共聚焦显微镜进行胞内 比例法只需激发一次，荧光染料不容易淬灭，这样能 pH值 (pHi)的测量。方法：SNARF-4F／AM和BCECF／AM均 保证实验的稳定性 。此外用激光扫描共聚焦显微镜 能被诱导胞内瞬时酸化和碱化 ，用单激发双发射比值测量法， 研究pHi变化成本比较高，因此，合理选择荧光探针 比较 SNARF．4F／AM和BCECF／AM的酸化和碱化与浓度线性 在整个实验 中尤为关键。 关系。结果：SNARF一4F／AM孵育的细胞能够被诱导胞 内酸 我们主要以研究前列腺上皮细胞DU145中钠氢 化和碱化，并能较好地反应出浓度与pH值的线性关系，同时 交换体(Na ／H exchanger，NHE)调节功能为模型， 其诱导酸化后 能够产生钠氢交换体 (Na ／H exchanger， 比较了以上BCECF／AM和 SNARF一4F／AM两种荧光 NHE)介导的回复相；BCECF／AM孵育的细胞虽然能够产生 探针在激光扫描共聚焦显微镜中的使用。 一 定程度的胞 内酸化和碱化，但是其诱导酸化后不能产生 NHE介导的回复相 ，说明利用 SNARF一4F／AM能正确反应细 1 材料和方法 胞内pH值的变化以及细胞膜上pH相关转运器的工作效率。 1．1 材料 前列腺癌激素非依赖性细胞株 DU-145，购 自 结论 ：SNARF一4F／AM染料 比BCECF／AM类染料更适合激光 ATCC。RPIM1640培养基、0．5g／L胰蛋白酶溶液和双抗均购 扫描共聚焦显微镜的使用。 自Invitrogen公司，胎牛血清 (FBS)购 自Hyclon公司，BCECF／ [关键词]激光扫描共聚焦显微镜；pH敏感染料；钠一氢交换 AM、SNARF一4F／AM购 自MolecularProbes公司。其他试剂均 体 (Na ／H exchanger，NHE)；胞内pH值 (pHi) 购 自广州化学试剂厂。LeicaTCS—SP2激光扫描共聚焦扫描显 [中图分类号]R373．9 [文献标识码]B 微镜以及配套软件为ALA—VM8八道灌流系统。 1．2 方法 机体执行和维持各种不同的功能需要稳定的内 1．2．1 细胞培养 DU一145铺展面积 占培养瓶底面80％ ～ 环境，细胞内pH值 (pHi)的变化只有保持在一定的 90％汇合时，可以进行细胞传代。小心吸出旧培养液，加入 范围之内，细胞和机体的正常功能才能得以维持 。 适量胰蛋 白酶液消化 (约 1mL)，消化液的量 以盖住细胞最 因此，测定pHi是检测细胞和机体正常功能和反映 好。DU145细胞消化 2～3min。 内环境稳定性的重要指标之一。