第十章 酵母基因工程-08级.pptVIP

第十章 酵母基因工程 一、酵母表达系统概述 二、酿酒酵母表达系统 三、巴斯德毕赤酵母表达系统 四、酵母基因工程的应用（自学） 一、酵母表达系统概述 1、酵母菌的分类学特征 酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。 如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。 2、酵母菌表达外源基因的优势 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便； 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统； 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉； 能将外源基因表达产物分泌至培养基中； 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS）； 酵母菌是最简单的真核模式生物。 3、酵母表达载体 载体的基本构架：大肠杆菌和酵母菌的“穿梭”质粒。 原核部分：大肠杆菌中复制的起点序列(ori)和抗生素抗性基因序列。 酵母部分： 酵母菌中维持复制的元件：2μ质粒复制起点；自主复制序列(ARS)；整合型载体的整合介导区。 营养缺陷型基因序列、抗生素抗性基因序列 基因启动子和终止子序列 信号肽序列 载体的复制形式 附加型载体：在酵母染色体外自主复制 酿酒酵母2μ质粒的DNA的复制元件所构建的 酵母基因组DNA的自主复制序列ARS所构建的 整合型载体：随同酵母染色体一起复制 含有与受体菌基因组有某种程度同源性的一段DNA序列，介导载体与宿主染色体之间发生同源重组。 常用的外源基因整合靶位点：rDNA 4、宿主 广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括： 酵母属酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 克鲁维酵母属乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 毕赤酵母属巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 裂殖酵母属非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） 汉逊酵母属多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。 5、酵母DNA转化 原生质体法：早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2% 离子溶液法:酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA。 103~104个转化子/μg DNA 电穿孔法(electroporation)和粒子轰击法(particle bombardment)：酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA。105个转化子/μg DNA 6、酵母分泌外源蛋白的糖基化 酿酒酵母分泌的多数外源蛋白均是过度糖基化的(40个甘露糖残基)； 巴斯德毕赤酵母分泌表达糖蛋白的寡糖链平均长度约为8~14个甘露糖残基 解脂耶氏酵母外源蛋白金含短的寡糖链(8~10个甘露糖残基) 酿酒酵母分泌的外源糖蛋白不适合作为药物治疗使用。 二、酿酒酵母表达系统 1、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 酿酒酵母是发酵工业中的主要生产菌株，是最先建立的酵母表达系统。 应用：乙型肝炎疫苗、人胰岛素、粒细胞集落刺激因子 酵母表达系统的不足 较难进行高密度发酵：发酵时产生乙醇，影响生长代谢和基因产物表达； 蛋白质的分泌表达能力较差； 蛋白质的加工过程发生过度糖基化作用。 2、酿酒酵母的附加型载体 pUC质粒的复制起点和ampr抗性基因 酵母菌的2μm质粒的复制区 酵母转化的选择元件：LEU2(亮氨酸合成酶基因)；HIS4(组氨醇脱氢酶基因)；URA3(尿嘧啶合成酶基因)。 表达盒式结构组成： 启动子常用乙醇脱氢酶启动子(PADH1)和半乳糖诱导型启动子(PGAL)。 分泌信号用酿酒酵母自身α-交配因子的分泌信号 终止子用CYC1基因的转录终止子 三、巴斯德毕赤酵母表达系统 1、巴斯德毕赤酵母 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。 应用：乙型肝炎表面抗原、肿瘤坏死因子、表皮生长因子和链激酶 2、巴斯德毕赤酵母表达系统的优点 启动子强并受甲醇严格诱导，可用于调控外源基因的表达； 能对重组蛋白进行翻译后必要的剪接、折叠和修饰，糖基化接近高等真核生物；