VEGF165基因转染大鼠骨髓基质细胞的实验研究.pdfVIP

VEGF165 基因转染大鼠骨髓基质细胞的实验研究1 白晓峰，田卫东，陈希哲，李志勇 四川大学华西口腔医学院口腔颌面外科 （610041） e-mail：bxfwcums@ 摘 要： 目的 探讨对大鼠骨髓基质细胞进行重组人血管内皮细胞生长因子 165基因修饰的 可行性。方法 采用全骨髓细胞贴壁培养法获得稳定的大鼠骨髓基质细胞，分别在脂质体 LipofectMINE2000 和新型的阳离子聚合物 Sofast 介导下行 pcDNA3.1-VEGF165 转染骨髓基 质细胞，在倒置显微镜下观察转染后细胞形态和生长情况的变化，通过免疫细胞化学鉴定 VEGF在细胞中的表达情况。结果 免疫细胞化学证实两种方法均能成功地将人血管内皮细胞 生长因子 165 基因转染至大鼠骨髓基质细胞中，并获得一定的表达。新型的阳离子聚合物 Sofast 的细胞毒性略小于传统的脂质体。结论 真核表达载体 pcDNA3.1-VEGF165 可以成功 地在骨髓基质细胞中表达，为进一步探讨组织工程血管化的研究奠定了初步的实验基础。 关键词： 血管内皮细胞生长因子，基因转染，骨髓基质细胞 1. 引言 组织工程学从 20 世纪 90 年代被正式提出以来，这一领域取得了卓越的成就，然而构建 功能性的复合组织结构或器官是一直困扰着生物医学领域的关键性问题。问题的焦点集中于 如何使重建或再生的组织内部获得血供而保证其正常的生长代谢。所以，为了把组织工程更 进一步的应用于临床医学领域，我们必须深入探讨血管再生和血循环重建的相关问题。对血 循环的重建而言，血管内皮细胞生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF） 无疑是最重要的生长因子，作为血管内皮细胞的特异性丝裂原，无论在生理还是病理状态下， VEGF都是血管形成最重要的调节因子，同时，VEGF通过刺激血管内皮细胞的游走进一步建立 新的血管网。VEGF也能改变血管的通透性，促进血浆蛋白的渗出，形成富含纤维素并有利于 新血管形成的细胞外基质[1]。实验表明骨髓基质细胞（Bone Marrow Stromal Cells, BMSC） 作为组织工程的种子细胞具有多向分化的潜能，是骨组织工程研究中较为理想的种子细胞之 [2] 一 。因此，本实验将对大鼠骨髓基质细胞进行人血管内皮生长因子 165 的基因修饰，以探 本课题得到教育部博士点基金（B12002060060 ）和教育部高校优秀青年教师教学科研奖励计划（2003682 ） 资助。 - 1 - 讨通过VEGF基因治疗来获得生物工程组织的血循环重建的可行性。 2. 材料和方法 2.1 材料 真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165 由第四军医大学口腔医学院高全文等提供[3] 。 LipofectMINE2000 购自美国Gibco公司，新型的阳离子聚合物Sofast转染试剂购自厦门太阳 马生物工程有限公司。鼠抗人血管内皮生长因子单克隆抗体及免疫组化试剂盒购自北京中山 生物技术有限公司。 2.2 pcDNA3.1-VEGF165 的提取与纯化 用已构建好的真核表达质粒载体 pcDNA3.1-VEGF165 转化大肠杆菌，按质粒提取试剂盒 中的说明书小量提取质粒，纯化后保存备用。 2.3 大鼠骨髓基质细胞的培养 取成年SD大鼠一只，引颈法将其处死后，取其股骨，剪去上下骺端，用含有 20%小牛血 清的ɑMEM培养液冲洗骨髓腔，将骨髓细胞冲入培养皿中，用吸管吹打使细胞尽可能的分散后 接种于培养瓶内。37℃、5%CO2饱和湿度下培养，48 小时后换液。多次贴壁法分离培养大鼠 骨髓基质细胞。以胰蛋白酶消化法进行传代。于倒置显微镜下观察细胞的形态和生长情况。 2.4 大鼠骨髓基质细胞的鉴定 用光学显微镜观测细胞的形态学特征。选取传代的 BMSC 在矿化诱导液