一种制备酵母菌线粒体DNA的简便方法ASimpleProcedureforPreparationmtDNAinYeast.pdfVIP

遗传 HEREDITAS(Beijing)18(2):46-481996 ·实验技术与方法 · 一种制备酵母菌线粒体DNA的简便方法① 金建玲 高 东 孙忠东 （山东大学微生物学系，济南250100) ASimpleProcedureforPreparationmtDNAinYeast JinJianling GaoDong SunZhongdong (MicrobiologyDepartment,ShandongUniversity,Jinan250100) 目前，制备酵母mtDNA的常用方法大致有两类：一是先提取混合DNA 核（DNA+mtDNA)，再通过CSCl 密度梯度离心或柱层析法分离纯化mtDNA ’（，，“’。〕；二是先通过蔗糖不连续梯度超离心法分离纯化线粒体，再 从线粒体中提取mtDNA ，（，．这些方法虽然能够得到纯度较高的mtDNA，但超离心法需要配套设备 超（速离 心机等），柱层析法对样品的回收浓缩比较复杂．本文报道的制备mtDNA的方法，不需复杂设备，简便易行， 对于一般实验室是一种切实可行的方法．国内在此方面的研究很少 ’（〕。 I材 料 与 方 法 1.1菌株 IFFI1300(Sxerevisiae）山东酒精总厂提供，1300-1,1300-5系本室经EB诱变获得的呼吸缺陷突变株P（7 1.2主要仪器 20PR-52D型日立高速冷冻离心机，55P-72型 日立超速冷冻离心机，UV-240型可见一紫外分光光度计，日 产大岳超声波破碎机 1（00W)，平板电泳仪等． 1.3药品与试剂 1.3.1药品 Snailase,ProteinaseK,DNasehRNaseA及SDS等购自华美生物T-程有限公司． 1.3.2细胞破壁用试剂 (1)菌体预处理缓冲液：O.Imol/LEDTA,pH8.0,O.lmol/L口一琉基乙醇． (2)蜗牛酶解缓冲液：0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.4,0.25mol/LMgC12,0.9mol/L山梨醇． (3）原生质体洗涤缓冲液：5mmol／LTris-HCI,pH7.5,Immol／LEDTA,0.9mmol／L山梨醇． 1.3.3分离纯化线粒体用试剂 (I）原生质体裂解缓冲液：1Ommol/LTris-HCI,pH7.5,5mmol/LEDTA,0.35mol/L山梨醇． (2）线粒体洗涤缓冲液：lOmmol／LTris-HCI,pH7.5,2mmol／LEDTA,0.5mol／L山梨醇。 (3)DNasel酶解缓冲液：在线粒体洗涤缓冲液中加人DNaseI，使终浓度为200pg/ml. (4）线粒体裂解缓冲液：线粒体洗涤缓冲液中含1%SDS和50Eeg/mlProteinaseK. mtDNA抽提试剂、琼脂糖电泳试剂以及Cscl超离心试剂的配制同文献 2〔). ①山东大学青年科学基金资助项 目。 2期 金建玲等：一种制备醉母菌线粒体DNA的简便方法 47 1.5方法 1.5.1菌体的破碎 将YPD ”培养基中生长24小时的野生型酵母1300的菌悬液离心洗涤，加入预处理缓冲 液，室温放置20--3G分钟，离心洗涤菌体，加人酶解缓冲液 含（蜗牛酶20mg／ml),30℃水浴30-60分钟。取 上述处理过的菌体加人5倍体积的玻璃珠，放试管振荡器中诚手摇）振荡30分钟． 1.5.2线粒体的制备和纯化 菌体经破壁处理后，在原生质体裂解缓冲液中破碎细胞，1500g离心 10分钟． 去沉淀．重复3次．18OOOg离心20分钟，取沉淀；加人线粒体洗涤缓冲液，1500g离心 10分钟，去沉淀； 18OOOg离心20分钟．所得沉淀即为线粒体．在线粒体中加人DNase1酶解缓冲液，。℃下处理2小时后， 18000g离心20分钟去除缓冲液，加人线粒体洗涤缓冲液洗3次，即得纯净线粒体． 1.5.3mtDNA的抽提和纯化 在纯净的线粒体中加人线粒体裂解缓冲液，37℃水浴保温 1小时，使线粒体裂 解．然后按常规方法 (2)从线粒体裂解液中抽提mtDNA，酒精沉淀即得mtDNA粗制品．用TE溶解，加 RNascA处理后再抽提，沉淀mtDNA，即得纯mtDNA. 1.5.4mtDNA纯