研究活细胞生命现象的新途径_绿色荧光蛋白基因的重组与表达.pdfVIP

998 年　9 月 首 都 医 科 大 报 Sep.998 第 9 卷　第3 期 Journal of Capital University of Medical Sciences Vol.9　No.3 研究活细胞生命现象的新途径 绿色荧光蛋白基因的重组与表达 首都医科大 北京神经科 研究所　田竟生　吴晓菁　潘海燕 　　绿色 荧光 蛋 白 (green fluorescence 行细胞、亚细胞和分子水平上的结构和功能 protein,简称GFP)是从发光水母(Aeg uorea 的研究。然而,90 年代始随着细胞影像技术 Victoria )分离出来的一种荧光蛋白, 它在蓝 的出现尤其是共聚焦显微镜的问世提供了直 光或近紫外光的激发条件下, 不需加入任何 接观察活细胞的可能性, 对 GFP 的遗传修 反应底物就可发射绿色荧光, 并由此而命名。 饰,包括GFP cDNA 克隆、点突变、定向打靶 纯化了的GFP 由238 个氨基酸组成, 相对分 等, 由于上述分子生物 理论和技术的发展, 子质量约27 000。激发光主峰395 nm, 还有 使得GFP 成为一种新的活细胞报告分子,在 一小峰470 nm 处蓝色光波范围。发射绿 某种程度上引起了一场新的生物 革命。 光:主峰509 nm, 肩峰540 nm, 该绿色荧光 　　意大利Padova 大 Rizzuto 等首先利用 十分稳定, 无光漂白现象发生。虽然完整蛋 DNA 重组技术构建成功嵌合型GFP[5]。他 白对荧光是需要的, 但是当它成为变性蛋白 们构建的策略是将 GFP cDNA-g5p 0 (.0 时还呈现同样的光吸收光谱为其特殊之处。 kb)重组到真核表达性质粒载体PCDNA I 的 GFP 色基来自主要的氨基酸序列即丝氨酸- EcoR 位点, 以该载体具有的巨疱病毒为启 去氢酪氨酸-甘氨酸(serine-dehydrotyrosine- 动子和增强子构成胞浆型GFP (cyt GFP)。 glycine)在六肽(hexapeptide)中的环化,但其 该质粒DNA 转染人宫颈癌细胞系(Hela)、原 形成发色团的机制尚属未知。Chalfie 等 代培养的脑皮质神经元、骨骼肌和肝细胞获 (994 年)为了探讨GFP 是否还需水母来源 0%～20%GFP 阳性细胞。结果表明:虽然 [ ] GFP 可在这些细胞的胞浆中表达, 但未在定 的其他因子方可发光 , 将水母 GFP 的 cDNA克隆转染异源细胞体系包括原核(大肠 向的亚细胞器中显示。于是他们又设计了在 mt 杆菌)和真核细胞, 当用蓝色光激发时均产生 线粒体中表达的 GFP, 即先对上述 GFP-0 强的绿色荧光, 由此得出以下2 个结论:①这 cDNA 进行 PCR 扩增, 再将 PCR 产物与 种荧光不需要发光水母提供任何附加的基因 HA (hemagglutinin)抗原决定基序列融合, 产物(或称附加因子);②发光色基的形成没 进而与含线粒体细胞色素氧化酶的前序列 有种系特异性,它的发生或利用细胞组分或 (pcox8 2 )连 接, 最 后插 入 Stratagene + 自身合成, 后者可能性最大。上述发现无疑 pBSK 载体。 由此路线构建的嵌合型线粒 为其后的研究奠定了基础。次年, Brand 报 体GFP (mt GFP)