人EGFL7基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定.pdfVIP

经 NeurosurgDisRes)2009：8(6 · 513 · 文章编号：1671—2897(2009)08—513—04 · 论著 · 人 EGFL7基因短发夹结构 RNA慢病毒载 体的构建及鉴定 黄纯海 李学军 罗勇 黄军 袁贤瑞 (吉首大学第一附属医院神经外科，湖南 吉 首416000；中南大学湘雅医院神经外科 湖南 长沙 410008) 摘要 目的 构建人类表皮生长因子域7(EGFL7)基因RNA干扰 (RNAi)慢病毒载体。方法 将靶向EGFL7基因的短发夹结构 RNA(shRNA)表达序列连接到包含 u6启动子及绿色荧光蛋 白 (GFP)报告基因的慢病毒载体pGCL—GFP中，获得重组质粒，命名为pGCL—GFP—vshEGFL7，经多聚酶 链反应 (PCR)和测序鉴定后 ，与慢病毒包装质粒 pHelper1．0及 pHelper2．0通过 lipofectamine2000 共转染至包装细胞 293T，包装产生病毒液，测定其滴度。结果 PCR扩增和测序结果证实 EGFL7shRNA核苷酸链序列插入正确 ，包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为4．8×10TU／ml。结论 成功构建人EGFL7基因shRNA慢病毒载体。 关键词 类表皮生长因子域 7； RNA干扰； 短发夹结构RNA； 慢病毒 中国图书资料分类号 R341．3 文献标识码 A Constructionandidentificationoflentiviralvector-mediatedshorthairpinRNA ofhumanEGFL7gene HUANGChunhai， ，』，Xuejun， LUOyng，HUANGJun， YUANXianrui Depa~mem ofNeurosurgery，FirstAffiliatedHospitd，Jishou Universi@，Jishou416000； Depa~ment of Neurosurgery，XiangyaHospital，CentralSouth University，Changsha410008，China Abstract Objective Toconstructalentiviralvector—mediatedRNA interference (RNAi)ofhuman epidermalgrowthfactor-likedomain7(EGFL7)gene．Methods AEGFL7genetargetingshorthairpinRNA (shRNA)wasclonedintolentiviralexpressionvectorpGCL—GFP，whichcontained I_16promoterandgreen fluorescentprotein (GFP)reporter．TherecombinedvectornamedpGCL—GFP—vshEGFL7Was confirmedby polymerasechainreaction(PCR)andsequencing，andWas cotransfectedwithpHelper1．0andpHelper2．0 packagingplasmidsmixturedinto293Tcellsbylipofectamine2OO0．Virusinthesupernatantwascollectedandthe virustiterwasmeasllred．Results PCR and DNA sequencingdemonstrated thattheinsertedsequenceswere correct．Th etiterofviruswas4．8X10 TU／m1．Conclusion Th elentivirusRNAivectortragetingEGFL7has beenconsturctedsuccessfully． Keywords EGF—likedomain7； RNA interference； ShorthairpinRNA； Lentivirus 类表皮生长因子域 7(epidermalgrowthfactor—like 能和信号转导途径提供 了强有力 的研