补骨脂胰蛋白酶抑制剂的亲和层析分离纯化和部分性质.pdfVIP

维普资讯 福 建 师 范 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) JO U RN AL O F FUJIAN NO RM AL U N]VERSITY 6(3)：68·72 CNATU RAL SC IENCE ) l990 补骨脂胰蛋白酶抑制剂的亲和层析分离纯化和部分性质。 朱苏闽 余 萍 黄德棋 林少琴 杨 良鹏 吴旭初 (高分子研究所 ) 摘 要 本文介绍牛胰蛋 白酶一对氨基苯碱 乙基 (ABSE)—sephsrose--4B的制 奋 ，夏 用 此隶和吸附剂分离提地补骨脂胰蛋 白酶抑刺剂的过程．用该方法对 补骨脂胰蛋 白酶抑制 剂粗提物进行分离，可获得 电泳单点纯样品．经SDS电泳测定，该抑制荆的分 子量为55000．等 电聚焦 电泳测定其等 电点为pI6．6，Chiff试剂染色为腮性．氨基酸组 成分析姑果表 明含 l2种氨基酸，其egGly、G}u含量最高． 关键饲；胰蛋 白酶抑制荆，补骨脂 ，亲和层析 中药补骨脂是豆科植物补骨脂 (PsoralaCoryHfoZloL，)的果实，具 有 补 肾壮阳， 止血的功用．我们曾采用离子交换层析和分子筛分离纯化补骨脂的胰蛋白酶抑制剂，但 未获得纯品…．本文作者改用固相化胰蛋白酶亲和屡析柱，分离纯化胰蛋白酶抑制剂， 并对该抑制剂的理化性质作了一些研究． ． 1 材料和方法 1．1材料 结晶牛胰蛋 白酶和对B一硫酸酯乙矾基苯胺 (SESA)为上海生化所东风试剂厂产品， Sepharose--4B为Pharmacia产品 |环氧氯丙烷(分析纯)为上海试剂一厂 产品’NaBH ‘ 为进 口分装品． 1．2方法 1．2．1胰蛋 白酶亲和层析柱的制备：取60克湿重 的Sepharosc--4B和 含 有 0．1克 NaBH~的50毫升lmol／LNaOH混合．在30℃水浴中一边搅拌一边滴加5毫升环 氧 氯 丙 烷，幔速搅拌 1O分钟后，水浴逐渐升温至 60℃，再慢速搅拌，继续反应 2小时．趁热 过滤，用近沸的蒸馏水洗涤至中性．将 凝 胶 浸 泡在 含0．1克 NaBH,的20毫升 2mol／L NaOH溶液中，在消毒锅 内120℃处理3O分钟 (约15磅压力 )，然后用近沸的蒸馏 水 洗 涤至中性备用． 将8克SESA悬浮于26毫升蒸馏水中，在搅拌下用1．7mol／LNazCO。调节pH至6， 待SESA溶解后3000r／m离5,20分钟去除残渣，上清备用． 本文于1990年3月5日收到． 维普资讯 补骨脂胰蛋 白酶抑制剂的亲和层析分离纯化和部分性质 在制得 的Sepharose--4B (经环氧氯丙烷交联后脱硫酸 )中加入4O毫升蒸馏 水，以 lmol／LNaOH调pH至l2，室温下放置2O分钟后移入沸水浴中搅拌，并加入 SESA溶液． 当反应物温度达到60℃时，立即滴加0．5mol／LNaOH溶液，调 pH至10，并继续 维 持 此 pH约45分钟．过毖后分别用300毫升0．5mol／LNaOH、300毫升蒸 馏 水 及 500毫 升 20嘶甲酰胺溶液洗涤，直至滤液 的ODzes小于0．02为止 ． 将 上述制得 的ABSE--Sepharose--4B悬浮于20毫升冷却的蒸馏水 中，搅拌下顺 序 3~k／4o毫升预冷的lmol／LHC1，及40毫升预冷的5嘶NaNO~溶液．置冰水中间歇搅拌反 应 15分钟，滤干后用预冷的400毫升0．05moI／LHC1洗涤3次，冷蒸馏水再洗涤3次 后滤 干．立即加入200毫克牛胰蛋白酶溶液 (以：150毫升pH9．5的0．05mol／LCaCI~配制)， 用2mol／LTHs调pH为7．5～7．8，室温下搅拌30分钟后滤干．凝胶分别用300~400毫升 3嘶NaC1和500毫升蒸馏水洗涤后装柱，以0．1mol／L