溴甲酚绿法测定血清清蛋白及批内重复性试验.pptVIP

【实验目的】 掌握： 1、溴甲酚绿法测定血清清蛋白的基本原理。 2、学习方法学评价之一批内重复性试验。 熟悉：1、 血清清蛋白测定的临床意义。 2、 批内重复性试验测定意义。 了解：溴甲酚绿法测定血清清蛋白的特点和注 意事项 。 【实验原理】 1．血清清蛋白在pH4.2的缓冲液中带正电荷，在有非离子型表面活性剂存在时，可与带负电荷的染料溴甲酚绿结合形成蓝绿色复合物，在波长600nm处有吸收峰，其颜色深浅与清蛋白浓度成正比例，与同样处理的清蛋白标准比较，可求得血清中清蛋白含量。 【试剂与器材】 1.工作试剂：琥珀酸缓冲液、溴甲酚绿BCG、表面活性剂-聚氧化乙烯月桂醚、防腐剂-叠氮钠 2.清蛋白标准液 可自行配制：如称取牛血清白蛋白4g、叠氮钠50mg，溶于蒸馏水中并缓慢搅拌助溶，配成100mL，密封贮存于4℃冰箱，可稳定半年。也可用定值参考血清清蛋白标准。 3.测定样品：人血清或其他待测样品。 4.仪器 ：漩涡混合器、分光光度计 【操作步骤】 1.手工操作法 取试管14支，按下表操作。 BCG法测定清蛋白操作步骤：(ml) . 【变异系数（CV%）值计算】 检验12次测定数据中的离群值，如存在异常值应剔除。对小样本量的测定，可以用Grubbs检验，其统计学公式是： Xd为离群值； 、 s分别为包括离群值在内的均值、标准差，如果计算的G值大于系数表(表3—2)中相应显著水平的“和测定次数12时的临界值Ga.n，则将Xd作为异常值舍弃，可按下述三种情况来处理： 2.剔除离群值后，再计算均值、标准差和变异系数。 【血清清蛋白测定的临床意义】 血清清蛋白浓度增高 常见于严重脱水所致的血浆浓缩。 血清清蛋白浓度降低 在临床上比较重要和常见，通常与总蛋白降低的原因大致相同。急性降低主要见于大出血和严重烧伤；慢性降低见于肾病蛋白尿、肝功能受损、肠道肿瘤及结核病伴慢性出血、营养不良和恶性肿瘤等。血清清蛋白低于20g/L，临床上出现水肿。 A／G比值 某些病人（如重症肝硬变有腹水者）可同时出现清蛋白减少和球蛋白升高的现象，严重者A／G比值＜1.0，这种情况称为A／G比值倒置。 文献报导还有极少见的因清蛋白合成障碍，血清中几乎没有清蛋白的先天性清蛋白缺乏症 。 批内重复性试验测定意义 批内重复性试验能反映各次测定结果相互接近的程度，用于客观评价这种测定方法随机误差的大小 【评价】 本法操作简便、快速，胆红素、溶血和中度脂血症无干扰，既可手工操作，也能自动化分析，是目前国内测定血清清蛋白的最常用方法。 本法线性范围为10～60g/L，RCV4％。但该法与溴甲酚紫法比较，对血清清蛋白特异性稍差。 【思考题】 简述溴甲酚绿法测定血清清蛋白的基本原理。 简述血清清蛋白测定的临床意义。 可用于建立蛋白质测定方法的蛋白质特性有哪些? 经典和常用方法有哪些?（P95） 什么是批内重复性试验，它的测定意义是什么？ 1.简述溴甲酚绿法测定血清蛋白的基本原理？ 答：血清蛋白在PH4.2的缓冲液中带正电荷，在由非离子型表面活性剂存在时，可与带负电荷的燃料溴甲酚绿结合形成蓝绿色复合物，在波长630nm处有吸收峰，其颜色深浅与清蛋白的浓度成正比例，与同样处理的清蛋白标准比较，可求得血清中清蛋白的含量。 2.简述血清蛋白测定的临时意义？ 答①血清清蛋白浓度增多：常见于严重脱水所致的血浆浓缩。 ②血清清蛋白浓度降低：在临床上比较重要和常见，通常与总蛋白降低见于肾病蛋白尿.肝功能受损.肠道肿瘤及结核病伴慢性出血，营养不良和恶性肿瘤等。血清清蛋白低于20g/L,临床上出现水肿。 ③A/G比值：某些病人可同时出现清蛋白减少和球蛋白开交的现象，严重者A/G比值＜1.0，这种情况称为A/G比值倒置。 ④ 文献报导还有极少见的因清蛋白合成障碍，血清中几乎没有清蛋白的先天性清蛋白缺乏症。 3.可用于建立蛋白质测定方法的蛋白质特性由哪些？经典和常用方法由哪些？ 答：特性：如重复的肽链结构;酪氨酸和色氨酸残基对酚试剂反应或紫外线的吸收;与色素结合的能力；沉淀后的浊度；电泳的迁移率大小等。 经典和常用方法：①凯式定氨法 ②双缩脲法 ③酚试剂法④紫外分光光度法 ⑤染料结合法 ⑥化学比浊法 ⑦全自动电泳仪 4.什么是批内重复试验？它的测定意义是什么？ 答：批内重复性是将同一材料分成数份实际标本，在比较短的时间内进行多次分析测定（一般为20次），从而获得批内精密度数据，可以反映测定方法随机误差的大小。 * * 溴甲酚绿法测定血清清蛋白及批内重复性试验 浙江中医药大学生命科学学院