人血清白蛋白%2f人白介素-11在毕赤酵母中克隆与表达.pdf

摘要 摘要 能支持IL．6依赖的浆细胞瘤细胞系T1165生长。最基本的功能在于造血调控作用，在 体外对不同阶段的巨核细胞和血小板生成都具有特异的促进作用。体内注射hlL．11可显 著刺激巨核细胞集落(CFU．MK)生长和增加血小板计数，还具有促进消化道上皮损伤 恢复、调节脂肪细胞分化等多种生物活性。但是天然的白介素．11在在体内的半衰期较 短，为了达到延长其在体内的半衰期，本研究采用了把白介素．11和人血清白蛋白以无 连接肽的方式融合。 取人胎肺成纤维细胞，以DMEM刺激培养，提取总RNA，通过反转录得到编码人 I／ⅣDf I进行双酶切，将 pBlue／HI；对pBlue／HI和穿梭质粒pPIC9K分别用EcoR 1：经测序验证， HSA．IL．11融合基因克隆到表达质粒pPIC9K中构建重组表达质粒pPHll 所得到的表达载体中目的片段碱基序列和预期一致，读框正确。 将Sal 氨酸缺陷型标记和G418抗性筛选，得到抗0．75 过PCR验证，转化子中含有HSA．IL．11融合基因。 BMGY种子培养基培养细胞，经离心收集后，于BMMY诱导表达培养基在30℃， 200 d，经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE) r／min条件下，以甲醇为唯一碳源诱导3 达。定量测定结果表明，融合蛋白在诱导上清液中的表达量约为120 mg九。 对重组菌在摇瓶转速、诱导甲醇浓度、诱导时间、诱导pH、诱导温度等条件下进 行优化，得到的诱导条件为：诱导温度30℃，甲醇浓度5％，pH6，诱导细胞密度 D．D．600=60，在上述优化条件下HSA．IL．11的表达量为198mg／L。 效刺激B9．11细胞增殖，其IL．11生物学活性约为6．2×104 U／rag。 关键词：白介素一1l；人血清白蛋白；重叠PCR；融合蛋白；培养表达 ABSTRACT ABSTRACT Humaninterleuldn．1 PU．34cells．Itwas describedasa 1(IL．11)is by produced initially factor witll．otherfactorsinthe of half-life growth synergising regulationhematopoiesis．The ofnativeIL．11isshort．Inorderto the fusion HSA．IL．11was half-life．the prolong protein constructed theIL·11 toHumanSemm linker． Album(HSA)without bysplicing peptide TheCDNA IL．11wasobtainedImPCRwiththe oftotalRNA