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细胞凋亡的免疫检测技术 （Apoptosis immunoassay technique） 一、概述 细胞凋亡 （apoptosis,Apo）是细胞增殖的反面，探讨的是细胞死亡的方式与机制。凋亡一词 来源于希腊语。原指花瓣、叶片的脱落。自 1972 年 Kerr 首次提出细胞凋亡的概念以来，随着细胞 生物学、免疫学和肿瘤学的研究发展，最近几年人们对细胞凋亡的重大理论意义和实际意义有了更 深的理解。细胞凋亡是指在一定的生理和病理情况下，机体为维护内环境的稳定，通过基因调控而 使细胞自动消亡的过程。不同类型的细胞，在发生凋亡时的动力学过程也不一致，存在着一定的形 态学和生物化学的差异，但若干基本变化是大同小异的。其特征为：整个胞体呈浓缩状，有特异性 胞浆大泡，胞质、核质深染，核碎裂后被细胞膜包裹而形成凋亡小体 （apoptosis body）。它有别于 细胞死亡 （necrosis,Nec）。在琼脂糖凝胶电泳上显示出特殊的 DNA 梯状图谱。它的出现主要是由于 一种钙-镁依赖性核酸内切酶激活后，裂解染色质核小体 （nucleosome）之间的连接 DNA，将核小体 切割成 180bp～200bp 或其倍数的片段所致。Apo 是不可逆的过程，散在分布于组织中，形成的凋亡 小体，除核裂解外，外有膜包绕，内有完整的细胞器，凋亡小体在组织中很快被邻近组织细胞吞噬， 并在溶酶体中被降解。因此，Apo 不引起周围组织炎症及损伤。Apo 是机体自己启动，由细胞本身主 动控制，由基因指导的细胞自我消亡过程。因此，又称程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）。 光镜下，Apo 的典型形态学特征是核染色质广泛凝聚，细胞体积缩小，胞质浓缩，有凋亡小体 存在，细胞表面特化结构如微绒毛等丢失及细胞表面明显的迂曲。体内细胞凋亡过程发展非常迅速， 细胞常在数小时内完成 Apo 并降解，凋亡细胞仅出现数分钟就消失，故不适宜应用形态学方法（普 通光学显微镜检测法、荧光显微镜检测法、凋亡小体的电镜观察及凋亡指数和细胞活力的定量测定） 来检测。在生物化学方面，利用电泳技术证明核体断片的“DNA 梯状图谱”作为检测群体细胞发生 凋亡的一个指标。经过人们多年的研究发现，应用原位末端转移酶标记技术（TDT assay or TUNEL reaction）来检测细胞凋亡，其灵敏度高，特异性强，能早期显示未发生典型变化的凋亡细胞。它 是检测单个细胞早期出现凋亡现象的好方法。近几年，人们又发现了能更快、更敏感、检测细胞数 量更多的并能从更多方面证明凋亡和坏死的流式细胞分析术（flow cytometry，FCM 包括亚“G1” 峰检测法和末端转移酶标记技术）等。本章仅介绍免疫学检测方法。 1 热线电话：021－5446 0832 8009881995 E-mail:master@ 网址： 二、ELISA 法 （一） 原理 细胞凋亡的发生，是由于钙-镁依赖性核酸酶进入核小体间切割 DNA,产生 180bp～200bp 或其倍 数的核小体片段。而核小体由于与组蛋白 H2A、H2B、H3 和 H4 形成紧密复合物而不被核酸内切酶切 割。采用双抗体夹心酶免疫法，应用小鼠抗 DNA 和抗组蛋白的单克隆抗体，与核小体片段形成夹心 结构，可特异性检测细胞溶解物中的核小体片段。 （二）材料与试剂 1．采用Boehringer Mannheim 公司试剂盒，生物标记的小鼠抗组蛋白单克隆抗 体。 2．过氧化物酶（-POD）标记的小鼠抗 DNA 单克隆抗体 3．链霉亲合素包被的微孔板 4．DNA－组蛋白复合物，作为阴性对照。 5．ABTS 底物 6．溶解缓冲液 7．温育缓冲液 8．底物缓冲液 （三）样品 1．培养细胞或离体细胞的裂解物 细胞裂解步骤：收集细胞，离心后，用 200µl 溶细胞缓冲 液重新悬浮，室温下作用 30min。 2．培养细胞的上清液 3．血浆（血清） （四）操作方法 1．取样品离心后 （1 000r/min,10min）,吸取 20µl 上清液，加入