甘蔗锌指蛋白ShZP基因正义反义植物表达载体的构建及转化烟草.pdfVIP

第 30卷 第 9期 热 带 作 物 学 报 Vol-30 No．9 2009年 9月 CHINESE JOURNAL OFTROPICAL CROPS Sep．2009 甘蔗锌指蛋白ShZP基因正义反义植物表达 载体的构建及转化烟草 喻时周 ，。，张树珍 ，杨本鹏 p，蔡文伟 ，罗遵喜 ，顾丽红 农裹业显部曩热謇带作物翥生差物技蓥术秉重圭点葬开放篓实验蠢霎室海碍口571101 2海南大学农学院．海 口 570228 摘要 根据本实验室克隆的甘蔗锌指蛋 白ShZP基 因cDNA序列 ．在开放阅读框两侧设计特异 引物 ．通过 PCR扩 增引入相应的酶切位点，把甘蔗 ShZP基因的编码区 (大小为725bp)cDNA片段 。分别 以正 向和反向插入到中间 载体 pCRBI的Prd29A启动子和 NOS终止子之间，构建 了其正义植物表达载体 DCRBIShZP和反义表达载体 pCRBIantiShZP。采用冻融法分别将 pCRBIShZP和 pCRBIantiShZP导人根瘤农杆菌菌株 EHA105中．通过农杆菌 介导法对烟草进行转化 ，经过 12mg／L的 PPrr连续抗性筛选 ．共获得 23株抗性植株 ．对其中的5株转正义基 因 烟草植株和9株转反义基因烟草植株进行 PCR检测 ．分别获得 3株转正义基因的阳性植株和4株转反义基 因的 阳性植株 。PCR检测结果初步证明外源甘蔗锌指蛋白ShZP基 因已成功整合到烟草基 因组 中．这一研究为植物抗 逆基 因工程研究打下 了一定的基础 关键词 甘蔗 ；锌指蛋 白；植物表达载体：遗传转化 中图分类号 $566．1：Q943．2 锌指蛋白 znicfingerprotein)是一类具有 手“指状”结构特征．通过结合 Zn2+来稳定一种很短的可 自 我折叠成 “手指”的结构蛋白l【J。高盐 、干旱和低温等非生物胁迫是影响植物生长发育和作物高产的重要限 制因子 ，植物对逆境的应答主要通过效应基因和调节基因调控 ，而锌指蛋白是一个庞大的转录因子家族 。 它在基 因的表达调控 、细胞分化 、胚胎发育 、增强植物对盐渍逆境 的抵御能力方面具有重要作用嘲 目 前，在拟南芥3[1、棉花4[]、矮牵牛5【】、水稻 、小麦3删【、白菜圳【、马铃薯[-”、苹果 【、胡杨 【、橡胶 【、陆地 棉旧、油菜㈣ 等植物中已有锌指蛋白基因的报道 本研究将克隆得到的甘蔗ShZP基 因分别构建了其正义 植物表达载体和反义植物表达载体 ．通过叶盘法对烟草进行转化 ．以期为甘蔗5 基因的抗逆性分子研 究奠定基础 1 材料与方法 1．1 材料 烟草种子 (Nicotianatabacum L)红花大茎子叶、大肠杆菌 (DH5ot)、根瘤农杆菌菌株 (EHA105)和中间 载体 pCRBI由本实验室保存 ；各种限制性内切酶 、T4DNA连接酶 、PCR试剂 、AxyPrep质粒 DNA小量提 取试剂盒、AxyPrepDNA凝胶 回收试剂盒 、高保真 TaqDNA聚合酶 、pMD18一TVector、DL，2000DNA Marker等均购 自TaKaRa公司；1KbLadderDNAmarker(300bp一10000bp)购 自爱思进生物技术(杭州)有 限公司；PCR引物由上海生物工程公司合成 ；卡那霉素 (Kan)、链霉素 (Str)、羧苄青霉素 (Car)、利福 平 (Rif)、氨苄青霉素(Amp)、琼脂糖购 自Sigma公司。 基金项 目：国家863重点项 目 (NO．2008AA10Z114)和中央级公益性科研院所基本科研业务费资助 ：现代农业产业技术体系建设专项甘蔗综 合试验站站长经费资助。 作者简介：喻时周 ，硕士。研究方 向：植物基因工程应用。E-mail：yushizh0u2008@I63-c0m。 }通讯作者，杨本鹏。E—mail：y-bp@163．com；Tel：0898 收稿 日期：2009—03—12 修 回日期：2009—04—29 9期 喻时周等 ：甘蔗锌指蛋白ShZP基 因正义反义植物表达载体的构建及转化烟草 1331 1．2 方法