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05
Y17351
摘要
外源蛋白在大肠杆菌中重组表达时,常常会错误折叠或形成无功能的包涵
体。有多种方法能用于改善外源蛋白的重组表达,最常用方法是与分子伴侣共表
达或融合表达,但是后者需要高效的蛋白水解酶切除融合表达的分子伴侣。本研
究,构建了含有多个大肠杆菌分子伴侣的辅助表达载体,分析了它们的功能;利
etchvirus
用定点突变技术获得TEV蛋白酶(tobacco
protease)突变体,并分析了体
内和体外的活性,获得以下结果:
1.克隆分子伴侣编码基因。克隆大肠杆菌分子伴侣基因dnaK、dnaJ,grpE、
致。
2.构建分子伴侣表达载体。分别将分子伴侣基因插入pRSFDuet.1和
pC.DJCL(含dnaK、dn甜和c伽)。
groES,grpE,dn水andclpB诱导表达的条带明显,但是未检测到dnaJ的表达条
带。
4.分析分子伴侣表达载体的效应。共表达结果显示,分子伴侣促进玉米西罗
叶绿三酸:铁螯合酶和谷氨酸.1.半醛氨基转移酶的可溶性表达,但是对玉米尿卟
啉原III脱羧酶的可溶性表达没有明显促进作用。
5.改造TEV蛋白酶。以TEV蛋白酶$219V为原始体,定点突变疏水性氨基酸
残基,获得两种TEV蛋白酶突变体(TEVQprotease,TEVr
示TEV蛋白酶突变体的可溶性表达水平在重组大肠杆菌中有明显提高,每升菌液
纯化获得约165
mg的重组TEVQ蛋白酶,108mg的TEVF蛋白酶,明显高于报道的
野生型TEV蛋白酶。
6.分析了TEV蛋白酶的活体和离体活性。TEV蛋白酶与含有TEV酶切位点的
融合蛋白共表达,电泳显示能有效切割融合蛋白,利用纯化的TEV酶,消化纯化
的含有TEV蛋白酶酶切位点的融合蛋白,电泳显示它能有效切割靶蛋白,TEVQ
蛋白酶的活性明显高于TEVF蛋白酶。
综上所述,本文构建了两个分子伴侣辅助表达载体并分析了它们的表达水
平。研究结果显示分子伴侣对改善不同外源蛋白可溶性表达的效率不同,与靶蛋
白的内在性质有关;获得的TEv蛋白酶突变体,与报道的野生型相比,表达量得
到很大提升,在体内和体外都具有较高的活性,为TEV蛋白酶在蛋白的可溶性表
达及蛋白标签的应用奠定基础。
关键词:分子伴侣,TEv蛋白酶,定点突变,大肠杆菌
Abstract
is most usedhostfor
Escherichiacolithe of
extensively productionhomologous
inEcoli
recombinant oftenfailto foldand
proteins.However,the
proteins properly
asinclusionbodies.Theseveral determinedto
were
overexpressed chaperones help
the
recombinant orasthefu
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