Folin-酚法测定蛋白质含量.docVIP

Folin-酚法测定蛋白质含量 一、 目的掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法，熟悉分光光度计的操作。二、原理Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin 试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范围为5～100μg 蛋白质。Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料绿豆芽下胚轴（也可用其它材料如面粉）2．仪器（1）722 型（或721 型）分光光度计（2）4 000r/min 的离心机（3）分析天平（4）容量瓶（50mL）（5）量筒（6）移液管（0.5mL、1mL、5mL）3．试剂（纯度均为分析纯）（1）0. 5mol/L NaOH(2) 试剂甲：（A）称取10g Na2CO3，2g NaOH 和0.25g 酒石酸钾钠，溶解后用蒸馏水定容至500mL。（B）称取0.5g CuSO4·5H2O，溶解后用蒸馏水定容至100mL。每次使用前将（A）液50 份与（B）液1 份，即为试剂甲，其有效期为1d，过期失效。（3）试剂乙：在1.5L 容积的磨口回流器中加入100g 钨酸钠（Na2WO4·2H2O）和700mL 蒸馏水，再加50mL 85 ％磷酸和100mL 浓盐酸充分混匀，接上回流冷凝管，以小火回流10h。回流结束后，加入150g 硫酸锂和50mL 蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色（倘若仍呈绿色，再滴加数滴液体溴，继续沸腾15min）。然后稀释至1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存，使用前大约加水1 倍，使最终浓度相当于1mol/L。四、操作步骤1．标准曲线的制作（1）配制标准牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精确称取0.0250g 结晶牛血清白蛋白，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解后转入100mL 容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，则配成250μg/mL 的牛血清白蛋白溶液。（2）系列标准牛血清白蛋白溶液的配制：取6 支普通试管，按表1 加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液和蒸馏水，配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液。然后各加试剂甲5mL，混合后在室温下放置10min，再各加0.5 试剂乙，立即混合均匀（这一步速度要快，否则会使显色程度减弱）。30min 后，以不含蛋白质的1 号试管为对照，用722 型分光光度计于650nm 波长下测定各试管中溶液的光密度并记录结果。（1）标准曲线的绘制：以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准曲线。2．样品的提取及测定（1）准确称取绿豆芽下胚轴1g，放入研钵中，加蒸馏水2mL，研磨匀浆。将匀浆转入离心管，并用 6mL 蒸馏水分次将研钵中的残渣洗入离心管，离心4 000r/min、20min。将上清液转入50mL 容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，作为待测液备用。（2）取普通试管2 支，各加入待测溶液1mL，分别加入试剂甲5mL，混匀后放置10min，再各加试剂乙0.5mL，迅速混匀，室温放置30min，于650nm 波长下测定光密度，并记录结果。五、结果计算计算出两重复样品光密度的平均值，从标准曲线中查出相对应的蛋白质含量X（μg），再按下列公式计算样品中蛋白质的百分含量。六、附注（1）进行测定时，加Folin 试剂要特别小心，因为Folin 试剂仅在酸性pH 条件下稳定，但此实验的反应只是在pH10 的情况下发生，所以当加试剂乙（Folin 试剂）时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。（2）本法也可用于游离酪氨酸和色氨酸含量测定。七、思考题1．含有什么氨基酸的蛋白质能与Folin-酚试剂呈蓝色反应？2．测定蛋白质含量除Folin-酚试剂显色法以外，还可以用什么方法？参考答案1．含有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）能与Folin-酚试剂反应呈蓝色，因为Folin-酚试剂在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钼兰和钨兰混合物）。2．除Folin-酚试剂显色法以外，紫外吸收法也可以进行蛋白质含量的测定。蛋白质在280nm 下具有最大的吸收值，这是由于含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸所引起的。若将已知不同浓度的蛋白质在280nm 处测定，并作标准曲线，即可求得未知溶液的蛋白质浓度。