蛋白质相互作用技术.pptVIP

常用蛋白质相互作用技术介绍 持续交换和非细胞体系的原理 * SPR技术分析蛋白质相互作用 体外转录和翻译鉴定蛋白质相互作用 coupled transcription/translation reaction 偶联的转录和翻译过程 continuous exchange cell-free (CECF) principle 持续交换和非细胞体系的原理 偶联的转录和翻译过程 T7-RNA polymerase E.coli lysate gene DNA coupled transcription / translation protein gene T7 RNA polymerase Translation machinery E. coli Energy regenerating system Protein DNA template Amino acids Energy substrates Buffer components NTPs Supply Amino acids Energy substrates Buffer components NTPs Supply Inhibitory by-products Inhibitory by-products membrane membrane 供给腔 反应腔 供给腔 microtiter- plate PCR tubes RTS 500 devices microcentrifuge tubes 4x12 RTS 100 8x 96x RTS 100 RTS500 反应装置 reaction chamber feeding chamber with semipermeable membranes RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit 质谱 X射线结晶学 核磁共振 结构生物学的蛋白标记 the amino acids and methionine are both provided separately from all other kit reagents other desired amino acids can be exchanged by using the RTS Amino Acid Sampler in combination with the RTS 500 HY RTS 500 HY Methionine specific labeling of proteins is possible by substituting the methionine or 结构分析 GST融合蛋白鉴定蛋白质相互作用 GST PULL-DOWN：通过与GST融合蛋白质探针蛋白质相互作用从可溶性蛋白质库中亲和纯化一个未知蛋白质，再通过GST与谷光苷肽偶联球珠的结合收集相互作用蛋白质，从而分离出蛋白质复合物。 1 含有表达质粒的细菌培养； 2 诱导表达； 3 收集菌体； 4 加蛋白酶抑制剂，冰上破碎细胞； 5 离心取上清，按1：1的比例加谷光苷肽琼脂糖球珠，在4C，温和混匀30分钟； 6 离心收集琼脂糖球珠，用PBS轻轻混匀悬浮，反复三次； 7 将混合物装柱，让PBS流出； 8 加还原性的GSH将融合蛋白洗脱； 9 SDS检测蛋白质纯化情况。 注意：绝大部分工作应在4C进行；对照？ GST融合蛋白纯化基本程序 免疫共沉淀鉴定蛋白质相互作用 当细胞在非变性条件下裂解时，完整细胞内许多蛋白质之间的结合保持下来，因而可以据此检测生理条件下相关蛋白质间的相互作用。如果蛋白质X用其抗体免疫沉淀，在细胞内与X稳定结合的蛋白质Y也可能沉淀下来。蛋白质Y的沉淀是基于与X的物理相互作用，被称为免疫共沉淀。 注意：绝大部分工作应在4C进行；对照？ 串联亲和纯化鉴定蛋白质相互作用和蛋白质复合体 Tandem affinity purificationTAP 将靶蛋白与蛋白质标签融合并在天然宿主细胞中表达，制备提取物，然后采用标准的两步法重获靶蛋白及与其相互作用的蛋白质组份。 *