双向电泳技术在植物蛋白质组学研究中应用.docVIP

双向电泳技术在植物蛋白质组学研究中的应用 摘要 从双向电泳的历史、原理、操作步骤及其在植物蛋白质组学研究中的应用等几方面进行综合阐述，最后提出双向电泳技术中存在的一些问题，并展望了其在植物蛋白质组学研究中的未来应用前景。 关键词 蛋白质组学；双向电泳技术；植物 中图分类号 q75；q945.7 文献标识码 a 文章编号 1007-5739（2012）20-0013-02 研究表明遗传信息通过基因携带，但基因结构的相对稳定性、数量的有限性，与生命现象的多变性、复杂性存在明显的差异[1]。为此，研究认为在所有生物体的细胞、组织、细胞器中，各种代谢反应、生理功能的维持均由各组成部分的表面、内部的蛋白质来完成。蛋白质组是wilkin s等在1994年第1次提出的。1997年蛋白质组的定义被其创造者重申为：“蛋白质组指的是一个基因组所表达的蛋白质。”2000年人类基因组序列草图的完成标志着“后基因组时代”的到来。蛋白质组学（proteomics）的概念最终被定义为“一个基因组、或一个细胞、组织在特定的生理和病理条件下表达的所有蛋白质”。蛋白质组具有特殊性和多样性，其研究的三大核心技术分别是双向电泳技术（two-dimensional gel electrophoresis，2-de）、生物质谱技术和生物信息学[2-3]。其中，2-de作为蛋白质分离的重要手段，是目前唯一可以在一块凝胶上同时分离上万个蛋白质的方法，且分离纯度可达90%以上。 1 双向电泳技术的历史 双向电泳技术自诞生以来，一直在不断的发展、改进。1975年o`farrell对大肠杆菌、老鼠及几尼猪蛋白质的研究中首次采用了双向电泳技术，称为iso-dalt（等电点-道尔顿）。其第一向是将载体两性电解质（ca）添加到丙烯酰胺凝胶中，凝胶聚合后在电场作用下形成连续的ph梯度进行等电聚焦；第二向是聚焦后的凝胶在含有sds的缓冲液中平衡后，用琼脂糖包埋到垂直板sds凝胶的浓缩胶上，形成不连续的sds梯度凝胶电泳[4]。这种双向电泳蛋白质由于上样量低，溶解性较差，可能会造成负性部分碱性蛋白丢失。另外，两性电解质在凝胶中扩散相对较容易，形成不够稳定的ph梯度，造成分辨率低，重复性差，此为经典双向电泳技术。 为克服经典双向电泳技术中出现的问题，gorg a 等于1985年研究出固相ipg-dalt（ph梯度-道尔顿）系统双向电泳技术，该技术以固相ph梯度为基础，使双向电泳技术有了质的飞跃。固相ph介质是一类丙烯酰胺化合物，与聚丙烯酰胺共价结合后可形成一定范围的ph梯度。与传统的双向电泳相比，ipg-dalt系统双向电泳技术具有上样量大、不产生阴极漂移、重复性较好、ph梯度稳定、分辨率高等优点。目前，ipg-dalt系统双向电泳技术在各国应用广泛。 荧光双向电泳技术（fluorescent two dimensional differ-ential gel electrophoresis，dige）在近年出现，是双向电泳技术的又一次飞跃，是一种对不同样品间蛋白质差异表达进行系统分析的技术。主要用于大样品蛋白质的差异鉴定。 2 双向电泳技术的原理及步骤 2.1 双向电泳技术的主要原理 双向电泳技术是目前蛋白质组研究中最常用的蛋白分离平台，是最高效、最直观的复杂蛋白质组分离技术。它利用各种蛋白质具有不同的分子量、等电点（pi）分离复杂蛋白质组，分辨率、灵敏度较高。其原理为：首先通过电荷分离蛋白质，利用一向等电聚焦将蛋白质沿ph梯度分离至各自等电点；然后沿垂直的方向通过非连续十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据蛋白质分子量大小差别来达到分离的目的。所得的蛋白双点是基于电荷分离和分子质量大小分离的正交组合，从而分布于整个二维凝胶图谱上，每个点代表其中一个或数个蛋白质，而蛋白质的分子量、等电点在样品中的含量也可显现出来 。 dige的原理是将需要比较的样品在电泳前用不同的荧光染料进行标记，被差异标记蛋白的等电点和相对分子质量基本不受影响，然后将其混合到一块胶内进行分离，并用相应波长来检测不同的荧光标记蛋白，最后用全自动蛋白质表达分析软件进行分析。它的出现有效地提高了双向电泳技术的重复性和定量的准确性。 2.2 双向电泳技术的主要操作步骤 双向电泳技术的体系较为复杂，通过多次摸索才能找到适合体系。ipg-dalt双向电泳技术的主要操作步骤如下。 2.2.1 蛋白质的提取。蛋白质提取的质量直接影响双向电泳试验最终结果，不同植物、不同组织蛋白应采取不同的提取方法。 2.2.2 蛋白浓度的测定。采用bradford法测定蛋白质浓度。 2.2.3 第一向ief电泳。在进行一向等电聚焦前应将相应的蛋白质与水化液