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实 验 四 凝胶过滤法测定 蛋白质分子量 一、 实验目的与要求 掌握凝胶过滤法分离蛋白质的原理 掌握凝胶过滤法测量蛋白质分子量的原理 掌握凝胶过滤法分离蛋白质的基本操作技术 二、实验原理 用于凝胶过滤的凝胶主要有： 葡聚糖凝胶—sephadex 琼脂糖凝胶—sepharose 聚丙烯酰胺凝胶—biogel 凝胶为不溶于水的颗粒状高聚物。颗粒为三维网状结构。 当被分离的物质其分子小于网状凝胶的网孔时，则分子就进入凝胶内部。洗脱时就会从一个凝胶颗粒出来而进入另一凝胶颗粒。则分子所经过的流程较长，如果分子大于凝胶网孔时，则分之不能进入凝胶网孔而从凝胶颗粒之间的空隙流出，流程较短。 分子越大 流程越短 最先出来 分子越小 流程越长 最后出来 被分离的物质的分子量的对数（lg）于其洗脱体积成反比 lgM Ve/V0 三、实验操作方法 凝胶溶胀 装柱 静置 测定外水体积（V0） 平衡 （蓝葡聚糖的洗脱体积） 标准曲线制作 （ cytc、牛血清蛋白、卵清蛋白） (一次上样洗脱测定其各蛋白质的Ve) 未知样品测定 （上样洗脱测定其Ve） 四．实验结果与分析 求出V0 求出各标准蛋白质的Ve 计算出各标准蛋白质的Ve/V0 以各Ve/V0为横坐标，标准蛋白lgM 为纵坐标作曲线 求出为知样品的Ve/V0，在标准曲线上查出相应的lgM 而求出其分子量大小 五．实验注意事项 凝胶要充分溶胀 上柱时凝胶不能有气泡和断层现象 上样时防止凝胶表面被破坏 ，不要滴加 洗脱时速度不能过快，同时防止冲动凝胶表面（ml/2-3min） 在上不同样品时，凝胶柱床要冲洗干净。 * * *
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