从成人正常睾丸中分离精子细胞及其cDNA文库的构建.pdfVIP

摘要 目的与意义运用流式细胞术和新型膜渗透性DNA荧光染色剂 SYBR．14从人类睾丸中分离单倍体的精子细胞，并构建精子细胞的 cDNA文库，以此来研究人类精子形成的表达谱。为高通量发现和寻 找精子形成相关的新基因，阐明精子形成的分子机制以及寻找基因治 疗精子形成障碍、免疫避孕、免疫性不孕的诊断新靶位点提供基础。 材料与方法标本为成人正常的睾丸。利用物理方法和酶消化制 ％)密度梯度离心，对精子细胞进行初步的纯化及富集；取22％密 度层细胞利用流式细胞术对精子细胞进行进一步的分选，根据细胞物 理参数FSC(forwardlightscatter)、SSC(90。lightscatter)从细胞 angle 形态和质地进行分选；再采用SYBR-14／PI荧光染色，通过DNA荧 光染色强度差别进行分选。所分选的精子细胞进行巴氏染色细胞形态 insitu 学分析、荧光原位杂交(fluoresce 混合探针)和PI染色后DNA含量检测。所获取的细胞采用SMART (SwitchMechanismAtthe5’endofRNA 文库。 梯度离心和流式细胞术分选出高纯度的精子细胞，利用细胞形态学、 荧光原位杂交(FISH)、DNA含量分析进行检测，显示其纯度90 ％。分选细胞的SYBR．14的荧光强度显示为单一峰，但CV0．08。 用所分选的细胞采用SMART技术构建精子细胞cDNA文库，原始文 pfu／ml，插入片段大小在0．5—2．OKb 2_f．q，平均长度为1．0Kb。在所 构建的成人精子细胞cDNA文库中成功扩增出精子细胞阶段特异性 表达的PRM2。 结论：1．从成人正常睾丸中利用流式细胞术分离出纯度为92．16 ％的精子细胞。2．验证了一种新型的膜渗透性DNA荧光染色剂 SYBR-14能够大致反映细胞的DNA含量。3威功构建了精子细胞的 cDNA文库。 关键词：精子细胞，睾丸，流式细胞术，cDNA文库 ABSTRACT IsolationandconstructionofeDNA of from libraryspermatids humantestis and Objectivesignificance：Spermatids，thehaploids，stained SYBR·1new DNA isolated 4，a stain，were by by membrane—permeant flow fromthehumantestisandcDNA of cytometry libraryspermatids inorderto the chaaof wasconstructed studyexpressionspermiogenesis， which withthefoundationofthe ofnew to provided discoverygenes moleculemechanismof new sitesof clarify spermiogenesis，andtarget the ofthefailureof immune therapy spermiogenesis，thecontraception andthe oftheimmune diagnos