细胞培养dun.pptVIP

* 将原培养瓶竖起，在30分钟内，若细胞沉于瓶底，可用吸管轻轻吸去一半上清弃去，再加入等量的新鲜完全培养基。若细胞不能沉于瓶底，可吸出细胞悬液，采用低速离心弃去一半上清加入等量的新鲜完全培养基，混匀后再转入原瓶继续培养。 * 可根据不同细胞种类、来源、实验要求和目的选择采用。 * (1)取对数生长期的细胞制成悬液(贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成)，经台盼蓝染色计数，测定活细胞数及浓度（细胞存活率及单个细胞百分率应高于90%以上）。 (2)将细胞悬液在试管中稀释，用培养基将细胞稀释至50个细胞/mL、10个细胞/mL、5个细胞/mL，将3种稀释度的细胞分别接种于96孔板中，每孔为0.1mL。 (3)次日在倒置显微镜下观察培养板各孔中的细胞数，挑选只含一个细胞的孔，做好标记并补加0.1mL培养液继续培养。 (4)培养期间，视pH值的变化决定是否换液或补加培养液，一周左右，孔中有明显克隆出现，待长至孔底面的1/3～1/2时，可用消化法将96孔中的单一克隆的细胞分别移至24孔板中进行扩大培养。 * 悬浮细胞用吸管吹打分散，贴壁细胞先用0.25%胰蛋白酶消化后，再用培养基吹打分散 细胞存活率及单个细胞百分率应大于90%以上 * 悬浮细胞用吸管吹打分散，贴壁细胞先用0.25%胰蛋白酶消化后，再用培养基吹打分散 细胞存活率及单个细胞百分率应大于90%以上 * 贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化使之分散成单个细胞 作活细胞计数 * 单个细胞在极低密度下生长非常缓慢，甚至难以分裂， 为了促进克隆细胞的生长繁殖，常采用饲养层细胞， 饲养细胞种类和制备方法依实验要求而定， * ①毛细管吸入法 同上述毛细管法，在显微镜下将只有一个细胞的毛细管取出。 ②微滴法 将经稀释至103个细胞/L的单个细胞悬液，用无菌的1mL注射器逐滴加在平皿中制成散滴，在显微镜下挑选出单个细胞的液滴，再用毛细管取出单个细胞悬滴。 ③液体石蜡法 将经稀释至103个细胞/L的单个细胞悬液，用无菌的1mL注射器逐滴加入充满无菌液体石蜡的平皿底部，在倒置显微镜下挑选只有一个细胞液滴，仔细用毛细吸管取出有一个细胞的液滴。 ④玻璃小球附着法 将稀释至103个细胞/L的细胞悬液加入表面涂有无菌凡士林石蜡的小玻璃珠的平皿中，混匀后，在倒置显微镜下挑选玻璃珠表面只粘附一个细胞的玻珠，仔细用镊子取出。 (4)将采用上述方法分离出的单个细胞，放入预先制备饲养层细胞的96孔培养板中，于37℃ 5% CO2下培养1~2周或更长。 (5)待细胞克隆明显，并使孔底覆盖1/3～1/2时，即可将细胞转种于24孔板进行扩大培养（贴壁细胞仍需用0.25%胰酶消化法取出转种）。 第五章 细胞培养 5.1 原代细胞的培养与维持 5.2 原代细胞培养的传代 5.3 细胞的纯化 5.4 细胞的克隆化 5.5 细胞的形态观察 细胞培养技术也叫细胞克隆技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养，既包括微生物细胞的培养，细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品都是从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。 消化初代培养法如左图。 对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。 5.1 原代细胞的培养与维持 原代细胞（primary culture cell）是指从机体取出后立即培养的细胞。有人把培养的第1代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养。 ①静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞)的培养的起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。 ②若原代贴壁细胞不是用于长期培养，只是用于分离繁殖或测定病毒之用，其细胞浓度可以加大，尽量贴成厚层以利病毒的效价提高和测定结果（如空斑）更加明显、准确。 ③待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，此时的pH若有明显变化，应将原代细胞换液，即倒去旧液，换入与原培养液相同的等量新鲜的培养基，以便除去衰老、死亡的细胞和陈旧的培养基，使贴壁细胞能获得充足的营养。 ④若希望细胞能在较长时间内能维持存活，但不需增殖，此时要换成含血清低的维持液。 ⑤悬浮细胞：凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞等悬浮细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞。 待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明细胞生长繁殖良好。 一般每隔3天需半