锯缘青蟹Sox基因HMG-box的克隆及其表达分析.pdfVIP

摘要 1990年，SRY基因的克隆和精确定位，掀开了哺乳动物性别决 定的神秘面纱。SRY基因在性别决定中极其重要且高度保守，许多进 化程度上明显不同的物种中都检测出SRY基因的HMG—box，即SOX 基因。 在系统进化中，虾蟹类处在承前启后的重要地位，与脊椎动物 相比，其性别决定更具有原始性、多样性和可塑性。锯缘青蟹是我 国重要海洋经济蟹类。其性别决定机制的分子研究薄弱，至今没有找 到性染色体。所以，以Sox基因这一保守基因为线索，研究其性别 分化对进一步探明锯缘青蟹的性别决定机制和Sox基因的进化都有 重要的理论意义。 本文包括锯缘青蟹Sox基因HMG-box的克隆和表达两个部分。 在第一部分中，参照人SRY基因HMG-box保守区的序列设计一对 兼并引物，采用PCR技术以雌、雄锯缘青蟹基因组DNA为模板进行 PCR扩增，结果雌、雄个体均扩增出一条约216bp的目的片段，与阳 性对照人SRY基因HMG-box保守区扩增片段大小一致，初步说明雌、 雄锯缘青蟹个体中均存在SRY基因的同源基因Sox。然后将PCR扩增 产物克隆到pGEM-T载体上，辅以PCR—SSCP分析技术筛选阳性克隆。 最后挑取10个阳性克隆(4个来自雌蟹，6个来自雄蟹)测序，经 Blast搜索表明，雌性锯缘青蟹的4个阳性克隆得到两种不同序列： 序列I和序列II，二者的比例为1：3，序列I和序列II片段长度均 I 为213bp，编码71个氨基酸。雄性锯缘青蟹的6个阳性克隆只得到一 种序列，与雌性锯缘青蟹序列II一致，为同一个Sox基因。Clustai w分析显示，序列I与序列II之间核苷酸同源性为69％，氨基酸同 源性为70％。依Sox基因家族7大亚族的划分，序列I为Sox—B亚族 成员之一，序列II是Sox-C亚族成员之一。锯缘青蟹雌、雄个体间 Sox基因成员的差异，暗示Sox基因在锯缘青蟹中可能有性别差异。 在本论文的第二部分中，通过以锯缘青蟹18SrRNA为内标的半 定量RT—PCR，研究性成熟雌、雄锯缘青蟹的性腺、肌肉、心脏和中 肠腺四种组织Sox基因的表达。结果显示，Sox基因在雌性的卵巢、 肌肉组织、心脏和雄性的中肠腺中表达量较低，而在雄性的精巢中 表达量较高，在雌性的中肠腺、雄性的肌肉组织和心脏没有表达。 表明Sox基因在锯缘青蟹雌雄个体中的表达存在组织特异性和性别 特异性。 本研究为探索锯缘青蟹韵性别决定机制以及Sox基因的进化等 提供了分子资料。 关键词： 锯缘青蟹； 性别决定； SRY基因： SOX基因 Abstract in the and ofSRY 1990thatdisclosed It the localization is cloning gene mammals．SRYall roleinsex ofsexdeterminationin veils gene key mystery plays in andWaS conserved mammals determination highly throughoutevolution，Sox toSRY．The ofSox alea of thatsimilar members family genefamily genes