大黄鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白基因克隆、表达及其基于a-溶血素转运系统分泌展示.pdfVIP

1大黄鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白基因的克隆、表达及其 基于α-溶血素转运系统的分泌展示 杨朝，刘琴，马悦，王启要，张元兴 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海（200237 ） E-mail：yxzhang@ 摘 要：以大黄鱼虹彩病毒(Large Yellow Croaker Iridovirus, LYCIV)基因组DNA为模板，基 于已报道的虹彩病毒主要衣壳蛋白(major capsid protein, MCP ）基因开放阅读框两侧的保守 序列设计引物，通过PCR扩增得到大黄鱼虹彩病毒的主要衣壳蛋白编码基因mcp 。将mcp基 因克隆入表达载体pET-16b ，进行表达纯化，并制备多克隆抗体。同时，将大黄鱼虹彩病毒 mcp基因克隆到含有完整大肠杆菌α-溶血素分泌转运原件的分泌表达载体pMOhly1上，分别 以大肠杆菌和鳗弧菌减毒疫苗株为宿主尝试MCP蛋白的分泌表达。结果显示，基于大肠杆 菌α-溶血素分泌转运系统，虹彩病毒MCP在大肠杆菌能够得到很好的分泌表达，而在鳗弧菌 减毒株中，却未检测到有效的分泌表达。 关键词：虹彩病毒，主要衣壳蛋白，α-溶血素转运系统，分泌表达，鳗弧菌减毒疫苗 中图分类号：Q7 1．引言 虹彩病毒(Iridovirus)是一类对鱼类、两栖类和爬行类水生动物具有广泛感染性的致病 病原，在过去的十年间在世界范围内，已从 20 多种鱼类中鉴定到虹彩病毒的存在[1，2] ，由 虹彩病毒所致疾病给世界水产养殖业造成了巨大的经济损失。虹彩病毒是一种直径大小为 ， ， 120 nm- 300 nm 的二十面体病毒，其基因组是170-200 kb 的双链线状DNA[3 4 5] ；虹彩病 毒的二十面体衣壳由一个单一的多肽——主要衣壳蛋白(Major capsid protein, MCP)组成，其 分子量约为49 kD, 是病毒粒子结构的主要成分[6]，它的氨基酸序列中有高度保守的区域， 且其基因和其编码氨基酸序列的同源性可以反映不同虹彩病毒株之间的亲缘关系，因此该基 因被视为虹彩病毒分子进化的标记。 鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是世界范围内海水和淡水鱼类弧菌性流行病的主要病原体之 一，可导致一种对鲑鱼、鳗鱼等许多鱼类高度致死的出血性败血病(Hemorrhagic septicemia)[7] [8] 。鳗弧菌野生株MVM425(O1 血清型) ，为本实验室分离并鉴定得到 。本实验 室前期工作得到了 MVAV6201 ，MVAV6203 等鳗弧菌减毒株，并证明以上菌株较野生株 MVM425 毒力明显下降[9]，有较大的潜力开发为成功的减毒活菌疫苗。这些高效价鳗弧菌减 毒株的研究进展为开发表达外源抗原的重组鳗弧菌活菌多效价疫苗提供了良好的载体菌株。 与在减毒疫苗周质中表达抗原蛋白相比，通过分泌或表面展示的方法表达的抗原具有更 高的 免疫原性[10] 。以大肠杆菌α-溶血素分泌系统为代表的蛋白Ⅰ型分泌系统由于其自身的 优点而得到了广泛的应用。大肠杆菌α-溶血素分泌系统由HlyB, HlyD, TolC 三个元件组成， 位于C 末端的由60 个氨基酸组成的信号肽HlyAs 可以被HlyB-HlyD-TolC 系统识别，从而 将融合蛋白直接分泌到胞外，而不形成周质中间体。质粒pMOhly1 是最常用的分泌表达质 粒[11] [12] 。本实验室已经利用该分泌表达质粒在MVAV6201 中成功的分泌表达 了绿色荧光蛋 白和鳗弧菌自身周质蛋白AngE ，因此本研究对一种抗原蛋白——大黄鱼虹彩病毒 MCP 在 鳗弧菌减毒株 MVAV6203 中的分泌表达情况进行了研究，进一步考察了α-溶血素分泌系统 分泌外源病毒蛋白