浙江大学生物化学实验甲 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量.pptVIP

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 该结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。 蛋白质与考马斯亮蓝G-250的结合在2min左右即可达到平衡，反应十分迅速，因此加完试剂后应立即摇匀使反应完全。 反应的灵敏度很高，比Lowry法约高四倍，因此是一种常用的快速测定微量蛋白质的方法。 且结合物在室温下1h内保持稳定，在5～20min之间，颜色的稳定性最好。 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 2、考马斯亮蓝法的特点 操作简便快捷；可测范围为0～1?000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质， 干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 但由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝法用于测定不同蛋白质时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 主要的干扰物质有：去污剂、?Triton?X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等。 3、实验材料及试剂 （1）、试验材料 待测蛋白溶液 （2）、试验试剂 0.1mg/ml的牛血清白蛋白 蒸馏水 考马斯亮蓝试剂 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 4、操作步骤 （1）、标准曲线的制作 取6支试管按下面的表格进行操作。 （2）、未知样品的测定 取试管两支标为7号和8号，按下面的表格进行操作。 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 5、实验结果及处理 （1）、标准曲线的制作 根据表格测出1~6管在595nm处的光吸收值，以蛋白含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 （2）、未知样品蛋白含量的确定及未知样品蛋白浓度的计算 测出未知样品在595nm处的光吸收值，通过标准曲线求出未知样品的蛋白含量并进而求出未知样品的浓度。 * * 1、考马斯亮蓝法的测定原理 考马斯亮蓝比色法是1976年由Bradford等人建立的一种快速测定微量蛋白质含量的方法, 又称Bradford法。 考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈棕黑色，最大光吸收在465nm。 在酸性条件下，考马斯亮蓝G-250可与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，生成蓝色的蛋白质-色素结合物。 A595 摇匀，室温放置10min后以1号管为参比测定各管的A595值 5 5 5 5 5 5 5 5 考马斯亮蓝试剂（ ml ） 0.5 0.5 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ ml ） 0.5 0.5 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.1mg/ml标准蛋白质溶液（ml） 8 7 6 5 4 3 2 1 管号 试剂