动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究Ⅰ．分泌抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立.pdfVIP

细菌病一猪其他细菌病 动物源性人兽共患细菌病防控生物新制剂的研究 I．分泌抗大肠杆菌0157：H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 夏兴霞1 刘洁1’2王永山1诸玉梅1欧阳伟1’2何孔旺1张雪寒1 (1．江苏省农业科学院兽医研究所／农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室／国家兽用生物制品工程技术研究 中心南京210014；2．南京农业大学动物医学院南京210095) 摘要将E．coli 骨髓瘤细胞融合后，获得七株分泌抗E．coli 检测，E7和Fl细胞培养上清液的效价为1．6×10 液的效价为l×10l~2×102，腹水效价均为4×102、2．5×106。相加ELISA结果显示，D3和H7mAbs对应相同的抗原 单克隆抗体，其它四株rr姨bs与某些其他血清型的大肠杆菌有交叉反应。westembloning表明，c3．E7和Fl三株 mAbsB8则未显示蛋白带。 关键词 肠出血，陛犬肠杆菌0157：H7；单克隆抗体(mAb)；生物制剂；人兽共患病 食源性病原微生物已成为当今不断增多的食品安全和突发性公共卫生事件的主要诱因。全世界 每年至少有200万人死于以感染性腹泻为主的食源性疾病，这类感染大部分是凶食品和饮水受微生 物污染所致II】。在食源性病原微生物中，肠出血性大肠杆菌(EHEC)占有重要地位。 EHEC主要包括0157：H7和026：H11。其中，大肠杆菌0157：H7是出血性肠炎的主要致病菌，经 溶血性尿毒综合征(HUS)及眦栓件血小板减少紫癜(TTP)等严重并发症，严重者日，导致死亡。 1982年美围亚特兰大疾控中心首次报道了由0157：H7引发的出血性肠炎，在此后的20多年中，由 0157：H7所致的疾病在全世界范喇内都有散发和暴发，尤其以1996年在口本的暴发流行影响较大。 国内，已有报道从腹泻患者及备禽粪便、市售肉类中，以及从猪、鸽、牛、鸡、鸭等动物中检测到 亡，引起了国务院的高度重视和全社会的广泛关注。世界性卫牛组织已将0157：H7列为新的食源性 病原菌。0157：H7的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与敏死性以及抗生素治疗可能会加剧 病情等特点，已成为全球性的公共卫生问题，获得简便、快速、敏感、实用的0157：H7快速检测方 法仍是当前食源性病原微生物防控研究亟需解决的I’口J题。 本研究旨在制备抗0157：H7的系列单克隆抗体，为该病原菌的快速检测、抗原结构分析及其致 病机理研究提供技术支撑。 1材料与方法 1．1材料 为兰州民海公司产品；■甲亚砜(DMSO)、弗氏完全佐剂、弗氏不完伞佐剂、聚乙二醇融合利 Kit)为Tllenno Iso帅ing 化物酶标记的羊抗鼠IgG((HRP—anti．mouseIgG)为本实验室制备；DAB显色液购自武汉博士德生 物上程有限公司；其他试剂均为分析纯。 基金项目：国家支撑计划资助项目(2007BAD40801) 566 第四次猪病学术研讨会会议论文集 1．2抗原制备 37℃灭活24h，超声破碎20nlin(超声时间ls，间隔ls)，测定蛋白浓度，．20℃冻存备用。 1．3杂交癌细胞株的建立 1．3．1 免疫动物 选择6～8周龄雌性BALB／c小鼠10只。首次免疫采用完全弗氏佐剂与等体积抗原液乳化物经腹腔 注射方法， 抗原量为0．5m∥只；14d后采用弗氏不完全佐剂与等体积 抗原液乳化物进行第一：次免疫，抗原最为0．5m∥只；再过14d后用单纯抗原经腹腔注射进行第三次 免疫，0．5m∥只；第三次免疫10d后，在进行细胞融合前3～5天用单纯抗原再次加强免疫。 1．3．2细胞融合 采用本实验室常规使用的细胞融合方法。无菌取免疫BALB／c鼠脾脏，制备免疫脾细胞，与对 数生长期的SP2／O细胞融合。将HAT选择培养液加入到细胞融合物，悬浮细胞，分配到已有饲养细 胞的96孔细胞培养板，置于37℃、8％C02的温箱中培养。 1．3．3筛选 以棋盘法确定0157抗体间接ELISA柃测方法的最适实验条件。以免疫抗原包被96孔板，用|’日J接 ELISA法检测融合细胞培养上清液。 lo．4杂交瘤细胞的克隆化 选择连续2次检测皆为阳性的杂交瘤细胞孔，用有限稀释法连续克隆2～3次。将克隆化的杂交瘤 细胞扩大培养，注射BALB／c鼠腹腔诱生单克隆抗体腹水、液氮冻存。 1．3．5诱生腹水 液，．20℃冻存备用。 I．3．6单克隆抗体的提