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含发夹结构的Gateway质粒DNA测序方法改进
第27卷第4期2008年 8月华 中 农 业 大 学 学 报
JournalofHuazhongAgriculturalUniversityVol.27 No.4Aug.2008,441~444
含发夹结构的Gateway质粒DNA测序方法改进3
刘 耘 熊家军 杨利国33
(华中农业大学动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室,武汉430070)
摘要 Gateway克隆技术现已广泛用于cDNA文库构建。然而,用常规DNA测序程序对GatewaycDNA进行测序时,反向重复的att序列易形成发夹结构,导致测序质量较差,且测得的序列较短,成为Gateway克隆技术应用的限制因素。本研究报道了1种GatewaycDNA克隆高温变性测序方法,即在GatewaycDNA测序PCR反应之前,先将DNA在98℃预变性5min,可有效防止测序峰值的快速下降,极显著地增加cDNA克隆测序长度(质量Q≥20的序列平均长度从528bp提高到816bp)。该方法在常规新增了5min的高温预变性,。
关键词 Gateway克隆系统;DNA测序;发夹;中图法分类号 Q785 文献标识码 A2)0420441204
噬菌体的重组整合
。该系统包括4个重组位点(attB,attP,attL和attR)和4种蛋白(整合酶Int,切除酶Xis,整合宿主因子IHF和能提高切除反应效率的FIS)。利用这一系统,Invitrogen公司开发了一种高效、适于大规模应用的基因克隆技术。每个Gateway入门载体上存在2个attP或attR位点,通过重组反应,可方便、高效地将一个两端带有attB或at2tL序列的DNA片段克隆到各种目标载体上。
Gateway克隆系统在一定范围内取代了传统的“酶切-连接”文库构建方法[126],已得到非常广泛的应用。Ohara等最早将Gateway技术用于构建cD2NA文库[728],2003年Invitrogen公司开发了专门用于构建全长cDNA文库的试剂盒。目前,该试剂盒已广泛应用于各种生物cDNA文库构建[9210]、基因克隆[11]、EST分析和表达谱分析[12213]。此外,由于重组反应cDNA保持了原有的/b-294cc4f1aef8941ea76e0557.html方向和开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF),因此该技术还可直接用于遗传转化研究,以探讨基因的功能[14]。
然而,用Gateway克隆系统构建的cDNA文库进行DNA测序时,2个反向的attB或attL序列之间容易形成发夹结构,用常规质粒DNA测序程序
很难获得好的结果。为克服发夹结构对DNA测序的影响,2003年Esposito等[15]设计了3′被修饰的不同长度封阻寡核苷酸片段,这些片段可以与测序引物远端att位点互补配对,阻止测序时形成发夹结构,从而提高测序质量。2003年Ducat等[16]用限制性内切酶在2个att位点中间任意位置将目的基因切断,阻止形成二级发夹结构。虽然这种方法能明显提高测序质量,但要在未知序列的目的基因上找到1个只有单一切点的限制性内切酶是很困难的。此外,由于增加了酶切步骤,增加了工作量和实验成本,不适合大规模Gateway质粒DNA测序研究。
本研究中,笔者报道了1种GatewaycDNA克隆高温变性测序方法。用这种测序方法和常规的BigdyeTerminatorV3.1测序试剂,在不增加成本和操作步骤的情况下,可以明显增加GatewaycDNA克隆测序长度,提高测序质量。
1 材料与方法
1.1 材 料
油菜苗期叶片Gateway表达cDNA文库(王芳博士提供)用CloneMinerTMcDNALibraryCon2structionKit构建。cDNA第1链和第2链合成、
收稿日期:20082042083国家“863”计划项目(2007AA10Z152)和国家“十一五”支撑项目(2006BAD04A02211)资助33通讯作者.E2mail:yangliguo3006@刘 耘,女,1969年生,在职硕士研究生,工程师.工作单位:华中农业大学动物科技学院,武汉430070
442华中农业大学学报第27卷
attB1接头连接、cDNA片段分级分离等均按试剂盒
变性DNA测序法与常规质粒DNA测/b-294cc4f1aef8941ea76e0557.html序法的反应
说明书操作。取分级分
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