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董昼土国堕盛丝生堑堂盘金!室渣金丛2墅《匡鲎垒耋亟》丝垒堑堂墨垒壅堂迨堑
质粒介导DHA-1型AmpC酶转录调控子
AmpR的分子生物学研究
多丽波 贺飞 栾英
哈尔滨医科大学附属二院检验科 150086
近年来在本地区检出头孢西丁耐药的肺炎克雷伯菌,多重PCR显示为质粒介导的DIM,
表型试验显示临床分离的头孢西丁耐药的肺炎克雷伯菌具有抗生素诱导表达特点,为此进
行调控诱导表达的转录因子AmpR的分子生物学特性研究,包括基因克隆测序、蛋白表达纯
化和鉴定、EMSA实验、以及蛋白质空间构象特点分析等。
材料和方法
菌株、质粒、培养基及相应区域引物:质粒介导DHA—l型AmpC酶肺炎克雷伯菌助1
coliDH5
为实验凶株;F Q感受态用于克隆、测序实验;占coliBL21(DE3)感受态用于克
u
氦‘鼻凶林(50g/m1)用于转化菌株筛选和蛋白质表达。见表l。
表1.试验中所用引物
引物 扩增序列
P1:5’.AGAAGGATCCCAGGTGGA,兀ATGGTCAGACG.3’
ampRFw
P2:5’.GGTAAAGCTTCTGGAAGGTGAGTGAG’I下兀’ACG一3’
ampRRw
Intercistronic
P3:5-GTCTGACCATAATCCACCTG7r-3’RegionFw
P4:5’.CAGAGCGGAAATCAGTGTTG.3’Intercistronic
RegionRw
P5:5’.Biotin.GTCTGACCAl’AATCCACCTGT-3。Intemistronic
Regionmv-Biotin
P6:5’.Biotin.CAGAGCGGAAATCAGTGTTG.3’Interctronic
RegionRw-Biotin
注:卜.划线字母代表酶切位点(上游:BamHI;一卜游:HindlI)
DNA
连接酶、高效制备感受态细胞试剂盒、质粒小量抽提试剂盒、PCR产物回收试剂盒(TIANGEN)、
BCA Protein 、 Extraction
AssayKit(Novagen)BugBusterProtein
ProteinPurification
Reagent(Invitrogen)、His·BindKit(Novagen)、预染蛋白质分
子量Marker
marker(TaKaRa)。
LB液体培养
ampR克隆、测序:肺炎克雷伯菌助1单个菌落接种到含氨苄西林的5ml
88
董昼主旦些盛丝生堑堂盘金(宝逵金丛2鳖《堡堂垒耋担》丝生堑堂墨叁壅鲎迨堑
设计ampR引物P1、P2(见表1),回收、纯化的扩增片段在T4DNA连接酶作用下与质粒pET-
coli
22b(+)连接,转化感受态FDH5。,LBamp+固体培养基筛选无色菌落,酶切鉴定。鉴
行比对。
Ecoli
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