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实验三 高等植物总DNA的提取和纯化 专 业：生物科学、生物技术 生物工程 学 时 数：6学时 一、实验目的 植物细胞中的DNA主要存在于细胞核内，称为核DNA或染色体DNA。天然状态的核DNA绝大多数是以脱氧核糖核蛋白的形式存在(DNP)，因此，提取和纯化DNA的关键是将DNA从细胞中释放出来并使DNA于蛋白质分开，同时尽量减少DNA的降解。 【思考题】 * * 学习和掌握提取和纯化高等植物总DNA的方法； 理解和掌握CTAB法提取植物总DNA的原理。 二、实验材料与主要试剂 （一）实验材料 高等植物幼叶（大蒜） 2×CTAB抽提缓冲溶液； （二）主要试剂 氯仿-异戊醇(24：1)； 无水乙醇，70%乙醇； 2×CTAB抽提缓冲溶液 2% CTAB(十六烷基三甲基溴化铵) 100mM Tris (三羟甲基氨基甲烷 pH 8.0) 20 mM EDTA (乙二胺四乙酸 pH 8.0) 1.4 M NaCl 1% 2-mercaptoethanol（巯基乙醇） 三、实验原理 目前，植物总DNA的提取方法主要有两种：即SDS法（十二烷基磺酸钠）和CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法。 阳离子去垢剂CTAB在高温条件下，可裂解细胞，离析染色体，变性蛋白质，使DNA与蛋白质分离而游离出来； 提取液中的EDTA（乙二胺四乙酸）则可以螯合金属离子，抑制DNase活性，使释放出来的DNA避免被降解； 在高盐浓度下，CTAB可与核酸形成复合物，并溶解于水相中，通过离心可将植物材料杂质去除； 最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。 利用有机溶剂抽提、离心，去除蛋白质、多聚糖和酚类等杂质； 1）2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热； 2）取少量叶片（200mg）置于1.5ml的灭菌离心管中，加少许提取液充分研磨； 3）加入800ul的2%CTAB 抽提缓冲液，剧烈振荡，充分混匀； 4）65℃水浴30min，每隔10min轻轻摇动； 5）冷却后，12000rpm离心15min，移上清至一新管中； 2. 实验步骤 6）加入等体积氯仿-异戊醇（24：1），颠倒混匀 2-3min，使两者混合均匀； 7）12000 rpm离心10 min，移上清至一新管中； 8）加入2倍体积预冷的无水乙醇，会出现絮状沉 淀，-20℃放置10分钟； 10）加入500ul 70%乙醇清洗沉淀2次，自然风干后溶于50-100ul灭菌水中，4℃冰箱保存备用； 9）4000r/min离心5min,小心弃去乙醇； 3. 注意事项 （1）叶片磨得越细越好； （2）注意移液器的规范使用； （3）由于植物细胞中含有大量的DNase,因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免细胞裂解后释放出DNA酶，使DNA降解。 本实验中所用试剂 CTAB, 氯仿, 预冷的异丙醇, EDTA的作用各是什么?