宿半夏SRAPPCR反应体系优化的研究.docVIP

宿半夏SRAP PCR反应体系优化的研究 [摘要] 目的： 研究宿半夏srap-pcr分子标记技术的优化体系。方法：采用l16（54）正交设计对宿半夏srap-pcr反应体系进行了5因素（dntps，mg2+，模板dna，引物，taq酶）4水平优化筛选。结果：半夏srap最适合的正向引物是5-tgagtccaaaccggaag-3，反向引物为5-gactgcgtacgaattacg -3。优化的反应体系为25 μl反应体系中含有70 ng dna模板，0.9 μmol·l-1引物，0.2 mmol·l-1 dntps，1.5～2.0 mmol·l-1 mg2+，2.0 u taq酶。结论： 宿半夏srap-pcr体系的建立为今后构建半夏srap遗传图谱奠定了基础。 [关键词] 半夏；srap-pcr；反应体系优化；正交设计 [稿件编号] 20121106013 [基金项目] 国家自然科学基金项目；安徽省自然科学基金项目（090413252）；安徽高校省级自然科学研究重点项目（kj2009a160）；宿州学院特色种植业苗种生产工程技术研究中心项目（2011ykf18） [通信作者] *薛建平，tel：（0561）3802025，e-mail： xuejp2000@ 半夏pinellia ternata breit.为天南星科半夏属多年生草本植物，是我国著名的中药材之一。据中国医学科学院统计，在558 种中药处方中，半夏使用频率居第22 位。半夏作为药用，在我国已有2 000多年的历史，是一味应用十分普及、疗效确切的常用中药材[1]。半夏在长期的人工栽培过程中出现了许多变异类型，因此对其种质资源进行分子标记研究具有重要的现实意义。其中相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，srap）分子标记技术通过一对正向引物与反向引物搭配扩增出基于内含子和外显子的srap多态性标记，该技术具有简单、稳定、在基因组中分布均匀等优点，已成功应用于药用植物遗传多样性分析和遗传图谱的构建等领域[2-4]。本研究主要应用正交设计的方法对srap-pcr反应体系中各因素进行筛选和优化，建立适合安徽道地药材宿半夏的srap-pcr反应体系，以期为srap技术在宿半夏遗传多样性的研究中应用奠定技术基础。 1 材料 供试材料由资源植物生物学安徽省重点实验室提供，经淮北师范大学生命科学学院薛建平教授鉴定为安徽道地药材宿半夏p. ternata的新鲜块茎。srap-pcr引物序列及pcr扩增试剂盒由上海生工生物技术服务有限公司合成、提供。 2 方法 2.1 半夏块茎基因组dna的提取与鉴定 半夏块茎dna提取采用优化ctab法稍作修改[5]。取宿半夏块茎0.5 g经70%乙醇消毒和蒸馏水洗净后，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，迅速转移到2 ml离心管中，并加入65 ℃预热的2×ctab抽提缓冲液500 μl于65 ℃水浴30 min。将离心管来回颠倒数次，加入等体积的氯仿-异戊醇（24∶1），轻轻混匀，使离心管中物质成乳浊状。室温下12 000 r·min-1高速离心10 min。取上层水相于另一干净的离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇（24∶1），重复抽提4～5次，直至界面清亮。取上清液转移到500 μl预冷（4 ℃）的无水乙醇中沉淀dna，室温静置2 min。10 000 r·min-1高速离心2 min使dna沉淀完全，离心后可观察到dna已沉淀到离心管底部，弃去上清液，用70%乙醇洗涤3次，室温干燥，溶于200 μl te中-20 ℃保存备用。dna的纯度鉴定利用核酸蛋白质分析仪在波长230，260，280 nm测定吸光度a，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna的质量。 2.2 引物的设计与筛选 引物设计参照邓瑞宁等[6-7]提供的srap引物序列，筛选5个正向引物与8个反向引物随机配对组成40对引物。srap-pcr反应体系包含10×reaction buffer 2.5 μl，dntps（2 mmol·l-1）1.25 μl，mgcl2（25 mmol·l-1）2.5 μl，正向引物（100 μmol·l-1）0.2 μl，反向引物（100 μmol·l-1）0.2 μl，模板dna（10 mg·l-1） 4.75 μl，taq酶（5 u·μl-1） 0.2 ，ddh2o 13.4 μl，总体积25 μl。反应程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃ 60 s，35 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共5个循环，94 ℃ 60 s，50 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共35个循环，72 ℃补齐10 min。其中正向引物序列（5-3）为me1 tgagtccaaaccgg