AAV-hVEGF165及AAV-TGFβ1转染兔椎间盘纤维环细胞的实验研究.pdfVIP

维普资讯 中华骨科杂志 2o06年 6月第 26卷第 6期 ChinJOrthoo。June2o06。V01．26，No．6 · 基 础 研 究 · AAV—hVEGFl65及AAV—TGF3[1转染兔 椎间盘纤维环细胞的实验研究 董跃福 胡有谷 王德春 摘【要】 目的 探讨应用hVEGF。与TGFDI基因逆转椎间盘退变的可行性。 方法 用分子克 隆技术 ，从 pcDNA3(+)一hVEGF。获得 hVEGF。6scDNA，并克隆至AAV包装质粒 pSNAV上 ，构建成 pSNAV—hVEGF1 的AAV重组质粒 。经酶切及测序鉴定后，用脂质体介导pSNAV—hVEGF 转染 HEK293细胞和血管 内皮细胞。荧光免疫组化方法检测hVEGF。蛋 白，并用 MTT法测定 hVEGF。对血 管内皮细胞增殖的影响。由本元正阳公司对 pSNAV—hVEGF。进行 AAV—hVEGF。包装 。AAV—hVEGF。 与 AAV—TGFDI联合转染退变 的椎 间盘纤维环细胞 ，Western blot检测 hVEGF。与 TGFDI的表达 以及 纤维环细胞 I型胶原表达量 的变化 。结果 经酶切鉴定及基 因测序证实 AAV包装质粒 pSNAV— hVEGF。构建完成 ，荧光免疫组化显示 hVEGF。蛋 白表达，MrI’法显示 hVEGF。蛋 白对血管 内皮细 胞增殖有促进作用。本元正阳公司包装出具有生物学功能的AAV—hVEGF。，AAV—hVEGF。构建成功。 Westernblot显示 hVEGF。与TGFDI在纤维环细胞 中表达 ，AAV—hVEGF。与 AAV—TGF~I双基因联合 转染的纤维环细胞 I型胶原表达量较 hVEGF。与TGF311基因各 自单独转染的细胞 I型胶原表达量明 显增多。结论 hVEGF。在体外能够协同TGF311促进退变纤维环细胞 I型胶原表达增加。 【关键词】 血管内皮生长因子A；转化生长因子B；椎间盘；胶原 I型 ConstructionofAAV—hVEGF懈 andthebiologicaleffectofhVEGFm andTGF~Iindegenerative annulusfibrosuscellofintervertebraldisc DONGYtte-fu,HUYou-gu,WANGDe--chun~Departmentof Orthopaedics，theA~ti,,tedHospitalofQing~oUnwersityMedcialc0如 ，Qi，唱d∞266003,China A【bstract】 Objcetive ToevaluatethereversionpossibilityofhVEGF1andTGF311tointerverte- braldiscdegenerationbygenemehtod．Methods nlehVEGF,65cDNAobtainedfromplasmidpcDNA3(+)一 hVEGF1wassubclonedintothepackagingplasmidpSNAVofAAVbymolecularcloneways．Therecombi- nnatplasmidpSNAV—hVEGF1岱wasidentifiedbyrestrictionenzymesanalysisnadsequencingnaalysis，nad htentransferedtotheHEK293cellna dVEC bylipofectaminemediatedgenetrna sfermehtod．Theprotein hVEGF1 wasdetectedbyimmunofluorecsenceforimmunocytochemistrynadexploredhteinfluencetohte proliferationofvasculra endohtelialcellbyMrI’I’．Whereafterhte从 V—hVEGF1岱Was packagedbyBenyuna ZhengyangCompany．AAV—hVEGF1andAAV-TGF311werecotran