抗人硫氧还蛋白-1单克隆抗体的制备与鉴定及初步应用.pdfVIP

!曼型!嫂Z二!!!!绳胞皇坌王鱼蕉堂盘查(垦h也』￡!!!丛!!!塑婴望翌!!)至塑墨：丝(盟 597 ·论著· 抗人硫氧还蛋白．1单克隆抗体的制备与鉴定及初步应用 唐文心，王建和，陈正望，陈孝平宰 (华中科技大学生命科学与技术学院生物物理与生物化学研究所，湖北武汉430074) [摘要] 目的：制备抗硫氧还蛋白·1(TRX一1)的单克隆抗体 1材料和方法 (mAb)并进行特性鉴定。方法：以原核表达的IRX一1为抗原 1．1材料 免疫BALB／e小鼠，按常规方法进行细胞融合。采用有限稀 释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株，用 DNA 存。MMLV反转录酶，DNA限制性内切酶，T4ligase， ELISA检测mAb腹水的效价、相对亲和力和进行表位分析， 用Westernblot法对mAb的特异性进行鉴定。结果：得到筛 选出3株能稳定分泌抗TRX．I的杂交瘤细胞株B6、D5和E3， 免疫球蛋白亚类均为IgG。(K)，腹水mAb效价均在106以上， 3株抗体分别针对不同抗原表位。用mAb建立的竞争抑制司产品。弗氏佐剂为GibeoBRL公司产品。4—6周龄雌性 ELISA灵敏度达1．22斗g／L。结论：获得3株特异性好、亲和 BALB／e小鼠(体质量18—22g)购自湖北省实验动物研究中 力高、能稳定分泌抗TRX-l的杂交瘤细胞株，为研究TRX·l 心。Sp2／0细胞由中国农业大学传染病与微生物学教研室提 在人类细胞、血液、组织中的表达及定位提供了可能，并为 供。酶联免疫检测仪为Labsystemsat．ason公司产品。Sepha- 探索相关炎症、癌症发病机制及新治疗方法提供了强有力的 dex 工具。 试剂盒为Pierce公司产品。其他试剂均为国产分析纯。 【关键词】人硫氧还蛋白-1；单克隆抗体；竞争抑制ELISA 1．2方法 【中图分类号】11392．11【文献标识码】B 1．2．1TRX．1的原核表达及纯化由上海生工生物工程技 术服务有限公司合成引物对：P1 GCCCTGAAGATCT一3’：P2 硫氧还蛋白-1(thioredoxin一1，TRX—1)相对分子 质量(M，)约为12000，属于进化保守的氧化还原蛋 白家族，具有活性中心(一Trp—Cys—Gly—Pro-Cys-Lys-)， 30 高保真DNA聚合酶pfu进行扩增，反应程序为：940cs， 它与TRX-1还原酶和NADPH共同构成调节细胞氧 55℃60 s，72℃40 化一还原状态的巯基氧化还原系统(TRX系统)。 I和XhoI将从pcD- 载体连接得到pcDNA-TRX—l。使用Kpn 1964年TRX．1在大肠杆菌中首次被发现至今uJ，被 证实广泛存在于原核、真核生物中，具有多种重要功 能，如抑制细胞凋亡、增加转录因子活性，刺激细胞 质粒转化大肠埃希菌B[21工程菌，以单菌落接种于LB培养 增殖及血管生成，作为DNA合成的辅助因子怛J。临基(含氨比西林50me／